楊保晴,張子愷,吳 昊,陳毓華,梁愛斌,傅建非

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院血液科，上海 200065)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndro-mes,MDS)是一組起源于骨髓造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，其特征是骨髓的一系或多系病態(tài)造血，外周血細胞減少及急性髓系白血病(acute mye-loid leukemia,AML)轉(zhuǎn)化等[1]。隨著二代測序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)的發(fā)展，越來越多在MDS中具有病理意義的基因突變被確定[2]。這些分子指標(biāo)對患者的疾病診斷、危險分層、預(yù)后評估和指導(dǎo)個體化治療等具有重要的臨床意義。然而，不同中心關(guān)于MDS基因的突變特征及其與臨床特征關(guān)系的報道不盡相同。本研究分析了同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院血液科62例MDS患者的基因突變譜及染色體核型、臨床特征、實驗室檢查結(jié)果、MDS亞型、IPSS-R積分等指標(biāo)，并探討了基因突變對上述指標(biāo)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

依據(jù)《骨髓增生異常綜合征中國診斷與治療指南》(2019年版)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、免疫分型、細胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和骨髓活檢等檢查明確診斷的62例初發(fā)MDS患者納入本研究。其中MDS伴單系病態(tài)造血(MDS with single lineage dysplasia,MDS-SLD)3例，MDS伴多系病態(tài)造血(MDS with multilineage dysplasia,MDS-MLD)32例，MDS伴環(huán)形鐵粒幼細胞(MDS with ring sideroblasts,MDS-RS)7例，MDS伴單純5q-1例，MDS伴原始細胞增多 Ⅰ 型(MDS with excess blasts subtype 1,MDS-EB-1)10例，MDS伴原始細胞增多 Ⅱ 型(MDS with excess blasts subtype 2,MDS-EB-2)9例，無MDS不能分類型(unclassifiable MDS,MDS-U)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 抽取初診MDS患者的骨髓血5 mL，EDTA抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法獲得單個核細胞，應(yīng)用Qiagen公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置-70 ℃冰箱備用。

1.2.2 NGS測序 所測基因均為與MDS相關(guān)、突變率高、較為熱門的34種基因。構(gòu)建34個MDS相關(guān)的基因文庫。通過Ion Ampliseq多重PCR擴展技術(shù)，一次性抓取待檢測的所有基因，并將構(gòu)建好的文庫用Life Technologies平臺Ion Proton半導(dǎo)體測序儀進行檢測。NGS擴增子平均基因覆蓋率達99%，平均測序深度1 000X，90%以上的序列可以與靶標(biāo)區(qū)目的序列比對上，靶標(biāo)區(qū)堿基覆蓋度較均一。致病性突變位點選擇主要根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南、專家共識、單核苷酸形態(tài)性數(shù)據(jù)庫(database of Single Nucleotide Polymorphism,dbSNP)、腫瘤中體細胞突變目錄(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer,COSMIC)等數(shù)據(jù)庫及參考文獻報道確定，均為已明確與MDS發(fā)病及預(yù)后相關(guān)的基因。34個高頻基因為ASXL1，BCOR，BCORL1，CALR，CBL，CEBPA，CSF3R，DNMT3A，ETNK1，ETV6，EZH2，F(xiàn)LT3，IDH1，IDH2，JAK2，KIT，KRAS，MPL，NF1，NPM1，NRAS，PHF6，PIGA，PTPN11，RUNX1，SETBP1，SF3B1，SRSF2，STAG2，TET2，TP53，U2AF1，WT1，ZRSR2。

1.2.3 染色體核型分析 采用常規(guī)G顯帶技術(shù)進行染色體核型分析。取患者初診時骨髓懸液2～4 mL，常規(guī)無菌細胞培養(yǎng)24～72 h，加入秋水仙堿在37 ℃培養(yǎng)箱孵育20～30 min，使細胞分裂靜止在中期，使用固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定，滴片并烘干玻片，常規(guī)G顯帶，染色體核型分析參考《人類細胞基因組學(xué)國際命名體制(ISCN2016)》進行描述。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗或Fisher確切概率法分析，計量資料采用秩和檢驗或t檢驗分析，基因型頻率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NGS測序結(jié)果

本研究的62例初診MDS患者中，共有52例患者至少攜帶1種基因突變，陽性率為83.87%，最多的同時攜帶6種基因突變。其中僅攜帶1種基因突變的有27.42%(17/62)，同時攜帶2種、3種、4種、5種、6種基因突變的患者分別為27.42%(17/62)、14.52%(9/62)、8.06%(5/62)、3.23%(2/62)、3.23%(2/62)。34種檢測基因中各基因突變發(fā)生率見圖1，其中IDH2、MPL、NF1、NPM1、CSF3R、FLT3、ETNK1、PIGA未檢測到突變，突變率最高的是TET2和DNMT3A基因，分別為19.35%和17.74%，其次為ASXL1基因(突變率16.13%)。突變率大于10%的基因還包括EZH2、SF3B1、U2AF1和TP53基因。從突變基因類型看表觀遺傳相關(guān)基因突變是MDS中最易受累的，有59.68%(37/62)的患者具有一種或多種表觀遺傳相關(guān)基因突變。其他如RNA剪接因子相關(guān)基因的突變發(fā)生率也較高。

2.2 臨床特征與基因突變的相關(guān)性分析

62例患者中男性40例，女性22例，年齡跨度為28～88歲，平均年齡為64.56±14.82歲，中位年齡為67.50歲，其中≥60歲47例，占75.81%。62例患者的MDS亞型分布見圖2，有32例患者核型異常。各亞型中，MDS-EB型基因突變最高，為(2.21±1.47)個。進一步根據(jù)NGS測序情況把62例患者分為NGS突變陽性組和NGS突變陰性組，比較兩組間的臨床特征，包括MDS亞型、血常規(guī)、核型、鐵蛋白、LDH、血清鐵、骨髓原始細胞比例、國際預(yù)后評分(IPSS-R)等指標(biāo)，見表1。統(tǒng)計結(jié)果顯示，NGS突變陰性組的白細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)均明顯高于NGS突變陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022 4、P=0.043 8)，而在其他方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 62例患者的MDS亞型分布Fig.2 The distribution of MDS subtypes in 62 patients

2.3 DNMT3A基因突變與臨床特征的相關(guān)性分析

62例MDS患者中共檢測到11例患者發(fā)生DNMT3A突變，陽性檢出率為17.7%(11/62)。所有患者均為雜合型突變，突變類型主要為移碼突變(1例，c.2193_2195del，p.Phe732del)和點突變(10例)。DNMT3A突變組和DNMT3A非突變組之間的年齡、性別、MDS亞型、血常規(guī)、血清鐵、鐵蛋白以及核型方面無顯著差異。但DNMT3A突變組骨髓原始細胞比例、IPSS-R評分均低于DNMT3A非突變組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018、P=0.016 9)，見表2。本研究進一步比較了DNMT3A突變組和NGS陰性組在上述臨床指標(biāo)的差異，統(tǒng)計分析顯示，DNMT3A突變組在LDH>250 U/L的發(fā)生率及IPSS-R評分方面均明顯低于NGS陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038 3、P=0.022 7)。這11例患者中有7例患者均合并其他基因突變，從合并突變類型看，仍然是表觀遺傳調(diào)控因子的比例最高。合并突變陽性的患者的平均年齡明顯低于合并突變陰性的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036)。

表2 DNMT3A突變組和DNMT3A非突變組患者臨床資料比較Tab.2 Clinical data of DNMT3A mutation group and DNMT3A non-mutation group

2.4 TET2基因突變與臨床特征的相關(guān)性分析

62例MDS患者中共檢測到12例患者發(fā)生TET2突變，陽性檢出率為19.4%(12/62)，是本研究中突變比率最高的基因。所有患者均為雜合型突變，突變類型主要為:移碼突變1例[c.4105_4108 del TCAG(p.Ser1369GlyfsTer78)]；點突變11例。12例TET2突變患者中有10例患者均合并其他基因突變，從合并突變類型看，仍然是表觀遺傳調(diào)控因子的比例最高。

TET2突變組和TET2非突變組之間在年齡、性別、亞型、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血清鐵、鐵蛋白、LDH、骨髓原始細胞數(shù)方面無明顯差別，但TET2突變組的血紅蛋白計數(shù)要明顯高于TET2非突變組(P=0.035 7)，TET2突變組異常核型發(fā)生率和IPSS-R評分要顯著低于TET2非突變組(P=0.040、P=0.044),見表3。進一步比較TET2突變組和NGS陰性組在上述臨床指標(biāo)的差異，統(tǒng)計分析顯示TET2突變組的血紅蛋白計數(shù)同樣要明顯高于NGS陰性組(P=0.035)，而TET2突變組的異常核型發(fā)生率要顯著低于NGS陰性組(P=0.035)。

表3 TET2突變組和TET2非突變組患者臨床資料比較Tab.3 Clinical data of TET2 mutation group and TET2 non-mutation group

2.5 TP53基因突變與臨床特征的相關(guān)性分析

62例MDS患者中共檢測到9例患者發(fā)生TP53突變，突變率為14.5%(9/62)。除1例患者為純合突變，其他均為雜合型突變，此純合突變?yōu)橐拼a突變[214_215 del CCinsGG(p.Pro72Gly)]，其他均為點突變。9例TP53突變陽性患者有6例合并其他基因突變，合并突變主要涉及表觀遺傳調(diào)控基因。

TP53突變組和TP53非突變組患者在年齡、性別、亞型、白細胞計數(shù)、血紅蛋白、血清鐵、鐵蛋白、LDH、骨髓原始細胞數(shù)、IPSS-R等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TP53突變組血小板計數(shù)及血清鐵水平明顯低于TP53非突變組(P=0.023、P=0.003)，而LDH水平和IPSS-R明顯高于TP53非突變組(P=0.001、P=0.002)，見表4。進一步比較了TP53突變組和NGS陰性組在上述臨床指標(biāo)的差異，統(tǒng)計分析顯示TP53突變組血小板計數(shù)、白細胞計數(shù)及血清鐵水平均明顯低于NGS陰性組(P=0.026、P=0.046、P=0.023)。

表4 TP53突變組和TP53非突變組患者臨床資料比較Tab.4 Clinical dataof TP53 mutation group and TP53 non-mutation group

3 討 論

MDS是一組高度異質(zhì)性疾病。原發(fā)性MDS中基因突變的檢出率近90%，對MDS的治療及預(yù)后評估有重要價值。在本研究中，83.87%的患者可檢測到至少一種基因突變，29.03%(18例)的患者可檢測到3種以上基因突變，突變頻率最高的基因是表觀遺傳相關(guān)基因，突變組的白細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)均明顯低于非突變組，說明基因突變加重了骨髓衰竭的程度，與國內(nèi)外報道一致。

TET2基因和DNMT3A基因都是表觀遺傳相關(guān)的重要基因。TET2突變與正常核型相關(guān)，但TET2基因突變的預(yù)后意義尚存在一定爭議。TET2基因突變在本研究的樣本中發(fā)生率最高，TET2突變組的血紅蛋白水平明顯高于TET2非突變組及NGS陰性組，而異常核型發(fā)生率顯著低于TET2非突變組及NGS陰性組。有研究表明，在MDS發(fā)生的較早階段，基因突變率低，表觀遺傳基因較RNA剪切因子較早發(fā)生[1]。Kosmider等[3]觀察到TET2突變是MDS中的常見分子事件，并且是預(yù)后良好的獨立預(yù)測因子，各種分化譜系亦提示TET2突變發(fā)生在疾病發(fā)展的早期[4]。本研究結(jié)果證實了這些觀點，TET2基因突變組具有更良性的臨床特征。本樣本中TET2突變位點均不相同，其中33.3%突變位點位于TET2基因的BOX1保守結(jié)構(gòu)域，包括錯義突變和移碼突變，導(dǎo)致正常的氨基酸編碼提前終止。DNA甲基化特異性抑制劑在MDS治療中，TET2突變陽性組療效較無基因突變組顯著[5-6]。另一項研究鑒定了213例接受阿扎胞苷或地西他濱治療的MDS患者中40個基因的突變[6]，當(dāng)排除ASXL1突變和TET2低頻率突變的患者時，這種改善反應(yīng)更加明顯(P=0.009)。這些研究均證實了DNA甲基化特異性抑制劑在該類基因突變陽性患者中的療效。而TET2基因BOX1保守結(jié)構(gòu)域的高頻突變也提示此結(jié)構(gòu)域有可能成為新的治療靶點。

越來越多的研究[7-10]證實了DNMT3A在MDS發(fā)病中的作用，但是不同研究對DNMT3A基因突變發(fā)生頻率的報道差異較大(2.6%～20.2%)。在本研究中，DNMT3A突變發(fā)生率僅次于TET2，為17.7%。1例患者檢測到的移碼突變致使第732位編碼氨基酸發(fā)生丟失，與不良預(yù)后相關(guān)，該突變既往在MDS患者有過報道[11]。1例患者檢測到錯義突變c.2645G>A(p.Arg882His)，為DNMT3A基因的熱點突變，該突變可降低酶的催化活性及其與DNA的親和力，可能與髓系惡性轉(zhuǎn)化有一定的相關(guān)性[12]。部分突變(c.1978T>Cp.Tyr660His，c.1969G>Ap.Val657Met，c.2146G>Ap.Val716Ile，c.1916T>G p.Leu639Arg)在淋巴瘤、AML患者有報道，但未見在MDS患者的報道，臨床意義不明確[13-15]。DNMT3A基因突變是急性髓系白血病的不良預(yù)后因素[12]，但其在MDS中DNMT3A突變與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性報道不一[7，16]。尚無研究揭示DNMT3A突變對生存的顯著影響，甚至有研究出現(xiàn)DNMT3A突變的患者接受異基因HSCT的患者比未接受異基因HSCT的患者具有更好OS(P=0.038)[17]。本研究中DNMT3A突變組骨髓原始細胞比例、IPSS-R評分均低于DNMT3A非突變組，DNMT3A突變組在LDH>250 U/L的發(fā)生率及IPSS-R評分方面均明顯低于NGS陰性組，提示DNMT3A突變并沒有導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)和AML轉(zhuǎn)化傾向，與Bejar等[6]的報道一致。本研究中11例DNMT3A突變陽性患者中有7例患者均合并其他基因突變，包括SF3B1等其他基因突變的存在可能削弱了DNMT3A突變對疾病嚴(yán)重度的負性影響，還需要進一步的前瞻性研究、更大的樣本量證實這一點。

TP53基因編碼的P53蛋白具有多種靶基因，很多都與細胞凋亡或細胞周期調(diào)控過程有關(guān)，通過與這些基因內(nèi)部或上游的P53反應(yīng)元件相結(jié)合的方式反式激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞死亡或生長停滯。在原發(fā)MDS中TP53基因突變發(fā)生率為5%～10%[12]，本研究中TP53突變發(fā)生率達14.5%，可能與本課題62例患者的年齡較大(平均年齡、中位年齡均高于國內(nèi)既往報道的數(shù)據(jù))有關(guān)。報道顯示TP53基因突變多發(fā)生在老年MDS患者中，年輕患者相對少見[18]。9例TP53突變陽性患者中，有1例為純合突變，其余均為雜合突變。突變頻率均高于40%，突變位點涉及TP53基因編碼蛋白的DNA Binding結(jié)構(gòu)域(如c.716A>Gp.Asn239Ser)，四聚體化結(jié)構(gòu)域(如c.1009C>Tp.Arg337Cys)等突變熱點，通過影響基因的正常剪切，降低轉(zhuǎn)錄活性，氨基酸編碼提前終止等方式影響基因正常功能。其中c.218T>C(p.Val73Ala)突變暫未檢索到與惡性血液疾病的相關(guān)報道。本研究顯示，TP53突變組在血小板計數(shù)、白細胞計數(shù)、LDH、IPSS-R等臨床特征方面差于TP53非突變組，提示了TP53突變患者的骨髓衰竭程度，疾病危險度分組均更差于TP53非突變患者，提示TP53突變患者預(yù)后不良。在11例僅攜帶1種基因突變的患者中，有3例患者僅攜帶TP53突變，亦說明TP53單基因突變亦具有較強的致病性。TP53靶向藥物Eprenetapopt已在骨髓增生異常綜合征患者中顯示了良好的抗腫瘤活性。TP53突變的MDS患者對Eprenetapopt和阿扎胞苷的聯(lián)合治療耐受性良好，可產(chǎn)生較高的臨床反應(yīng)率和分子緩解率[19]。更多TP53靶向藥物可能被研制出，有望改善MDS患者的預(yù)后。

綜上所述，本研究說明MDS患者基因突變發(fā)生率高，不同的基因突變與不同的臨床特征相關(guān)，深入研究MDS患者基因突變與臨床特征、疾病預(yù)后、個體化治療等方面的相關(guān)性具有重要意義。