何 歡，謝若蘭，丁森旭，余 江,2,3

1)四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川成都610065；2)四川大學(xué)新能源與低碳技術(shù)研究院，四川成都610065；3)四川大學(xué)宜賓產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川宜賓 644010

由于污灌、礦山開采和冶煉等人為活動，重金屬鎘(Cd)愈來愈多地暴露在環(huán)境中．Cd毒性較大，對糧食安全造成了極大危害[1]．因此，對Cd污染農(nóng)田的治理與修復(fù)已迫在眉睫．

單一重金屬修復(fù)技術(shù)均具有一定局限性，微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)由于成本低和安全綠色等優(yōu)點，受到廣泛關(guān)注[2]．植物促生菌是一種附著于土壤或者植物根際的菌類，近些年來被廣泛用于土壤重金屬污染修復(fù)研究領(lǐng)域[3]．植物促生菌能夠合成植物生長發(fā)育所必需物質(zhì)，增加富集植物生物量，提升植物萃取能力[4]．另一方面，植物促生菌還可改良土壤肥力，將土壤中氮、磷和鉀轉(zhuǎn)換為植物易獲取態(tài)，提升富集植物對土壤重金屬的富集效果[5]．在實際應(yīng)用方面，植物促生菌-植物聯(lián)合修復(fù)體系對修復(fù)土壤重金屬Cd污染方面擁有巨大潛力．MA等[6-7]報道了植物促生菌能顯著增加伴礦景天和香根草對Cd的富集能力．但從礦區(qū)周邊污染土壤中篩選植物促生菌，探究本土微生物對土壤理化性質(zhì)和Cd賦存形態(tài)的影響卻鮮見報道．因此，本研究在中國四川省川南地區(qū)某硫鐵礦區(qū)周邊污染農(nóng)田采集植物根際土壤，以重金屬壓力培養(yǎng)法及菌株促生特性進行初篩，通過室內(nèi)盆栽實驗，探究所篩選菌株對黑麥草的富集效果，以及對土壤理化性質(zhì)和Cd賦存形態(tài)的影響，以期為Cd污染農(nóng)用地的修復(fù)策略提供參考．

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

本實驗所用儀器有：UV2350紫外分光光度計(上海-尤尼柯儀器有限公司生產(chǎn))、LDZX-50KBS高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn))、HZQ-X500C恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn))、JSM-7500F掃描電子顯微鏡(日本捷歐路公司生產(chǎn))和303-2A電熱恒溫培養(yǎng)箱(紹興市嚴(yán)氏風(fēng)機有限公司生產(chǎn))．

1.2 培養(yǎng)基的配置及滅菌條件

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(1 L)： 胰蛋白胨10.0 g， 酵母浸出粉5.0 g， NaCl 10.0 g， 蒸餾水1 L， pH值為7.0～7.4． 配制LB固體培養(yǎng)基時加入1.5%～2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉．

無鐵培養(yǎng)基(1 L)：MgSO4·7H2O 2.5 g，KH2PO42.5 g，甘油0.5 g，酪蛋白胨5.0 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0～7.2．

無機磷培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖10.0 g，Ca3(PO4)25.0 g，MgCl25.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0．

滅菌條件：121 ℃，0.155 MPa，30 min．

1.3 實驗土壤及高濃度耐受鎘菌株篩選

本實驗菌株所用土壤系中國四川省川南地區(qū)某硫鐵礦區(qū)受污染農(nóng)田土，總鎘含量為3.47 mg/kg，有效態(tài)鎘含量為1.30 mg/kg．蒸餾水溶解3.0 g原土裝于三角瓶后，放置恒溫振蕩器中20 min．超凈臺中接種已滅菌LB培養(yǎng)基，接種量為1.5%．通過測定促生特性及高濃度Cd壓力培養(yǎng)法[8]，菌株在Cd的質(zhì)量濃度為250 mg/L的質(zhì)量培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長后，采用平板劃線法進行分離純化．保存1.5 mL菌液進行細菌種屬鑒定．

促生特性的測定：菌株產(chǎn)吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的測定參考文獻[9]的方法，產(chǎn)鐵載體能力測定參考文獻[10]的方法，溶磷能力測定參考文獻[11]的方法．

生長曲線的測定：將上述分離純化后菌液接種于已滅菌LB培養(yǎng)基， 接種量為1.0%． 依次添加10 g/L 的Cd2+母液，使LB培養(yǎng)基中Cd2+的質(zhì)量濃度為0～250 mg/L，采用D(600)值測定微生物生長曲線．

1.4 基因組DNA提取和PCR擴增

基因組DNA用DP336試劑盒提?。N鑒定通用引物為27F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTA CCTTGTTACGAC-3′)．聚合酶鏈反應(yīng)(polyonerase chain reaction, PCR)體系：I5 Mix 25 μL，PF(10P)1 uL，PR(10P)1 μL，gDNA 1 μL，dH2O 22 μL．PCR擴增條件：98 ℃ 預(yù)變性3 min，39個循環(huán)(98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s)，72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保留．PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目條帶，純化的PCR產(chǎn)物用引物直接測序．待測菌種送至北京擎科偉業(yè)生物技術(shù)公司進行測序．用NCBI的Genbank進行Blast比對，確定菌株分類．

1.5 實驗設(shè)計

設(shè)計空白對照組(CK)、YXL1、黑麥草、YXL1+黑麥草共4個實驗組，每組設(shè)置3個平行對照組，共計12盆，每盆裝土1.0 kg，栽植50株黑麥草，草籽購買自成都綠牧天下科技有限公司．

1.6 樣品采集及數(shù)據(jù)分析

土壤：黑麥草栽種45 d后，采集根際土壤，自然風(fēng)干，研磨后封存，測定pH值和有機質(zhì)、速效鉀、全氮、有效磷的質(zhì)量濃度[12]．鎘賦存形態(tài)采用BCR連續(xù)提取法[13]進行測定，每步結(jié)束后采用0.45 μm 聚醚砜樹脂濾頭過濾定容至10 mL離心管，4 ℃保存待測．

植物：黑麥草栽種45 d后，小心采集黑麥草植株樣品，用超純水洗凈，放入烘箱在105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重[14]．稱量測重，隨后加5 mL硝酸進行微波消解，4℃保存待測．

重金屬：用ICP-MS測定Cd含量，檢出限為1 μg/kg．

數(shù)據(jù)分析：運用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，OriginPro 10.1制圖．

2 結(jié)果與討論

2.1 促生菌株(重金屬抗性菌)促生特性分析

IAA是一種植物活性生長素，在調(diào)節(jié)植物生長和緩解重金屬脅迫方面有重要作用．SALAZAR等[15]發(fā)現(xiàn)IAA可以改善植物根系微生態(tài)環(huán)境，加強富集植物對土壤重金屬的富集能力．在鎘的質(zhì)量濃度為250 mg/L時分離出7種菌株，命名為YXL1～YXL7．測定7種菌株生產(chǎn)IAA、鐵載體以及溶磷的能力(表1)．從表1可知，YXL1生產(chǎn)IAA的能力最強，為31.56 mg/L，表明YXL1菌株具有較強的促生能力．當(dāng)植物根際鐵元素含量較少時，微生物分泌對Fe3+具有較強絡(luò)合作用的小分子物質(zhì)，即鐵載體．鐵載體通過與重金屬配位、螯和等多種化學(xué)作用，將重金屬從土壤中溶出，轉(zhuǎn)變?yōu)橹参镆滋崛B(tài)[16]．在實際應(yīng)用中，鐵載體能夠促進植物對土壤中Cd的萃取[17-18]．本研究中除YXL5外，其他6種菌株的產(chǎn)鐵載體能力均大于0.5，原因可能是受試土壤周邊存在歷史遺留硫鐵礦礦渣堆體，從而導(dǎo)致鐵元素土壤背景值含量較高，使得微生物產(chǎn)鐵載體能力較弱．植物促生菌的溶磷能力能夠加快土壤中的無機磷向植物易吸收形態(tài)轉(zhuǎn)化的進程．KUMAR等[19]發(fā)現(xiàn)具有溶磷能力的細菌可以增加小麥產(chǎn)量．YXL1和YXL2有較強溶磷作用，分別為46.18 mg/L和34.89 mg/L，表明YXL1和YXL2具有較強的將土壤中磷轉(zhuǎn)換為植物易獲取磷的能力．通過產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體與溶磷能力，綜合篩選出YXL1為促生特性最優(yōu)細菌，用于開展后續(xù)室內(nèi)盆栽實驗．

2.2 重金屬抗性菌的分離、鑒定結(jié)果分析

通過高質(zhì)量濃度Cd壓力培養(yǎng)法，YXL1在接種3次并穩(wěn)定生長后，采用平板劃線法進行分離純化，于LB培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)該菌株呈淡黃色、圓潤、有光澤、中間略微隆起，見圖1(a)．通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)發(fā)現(xiàn)菌株呈長桿狀，見圖1(b)，平均長度為5 μm．表明高濃度Cd2+并未明顯改變細胞形態(tài)，YXL1對Cd2+具有較強的耐受能力．

國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多種能夠促進植株生長的根際微生物[20-21]，表明植物促生菌種屬對于構(gòu)建微生物庫至關(guān)重要．在NCBI的GenBank中進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)YXL1與伯克霍爾德氏菌株同源性為99%，可確定YXL1菌株為伯克霍爾德氏菌．利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建YXL1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，各節(jié)點平均置信度高于70(圖2)．

圖2 基于16S rDNA的YXL1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of YXL1 based on 16S rDNA

將YXL1以1%接種量接種于100 mL三角瓶中，培養(yǎng)24 h，測定菌株生長曲線(圖3)．由圖3可見，在0～5 h，YXL1細菌處于適應(yīng)期，生長速率較為平緩，于5～20 h迅速繁殖，20 h后達到生長穩(wěn)定期．此外，Cd2+對細菌生長具有較強的抑制作用，添加Cd2+時D(600)值小于未添加Cd2+時，表明Cd2+對YXL1生長有較強抑制．當(dāng)Cd質(zhì)量濃度大于200 mg/L時，在前11 h培養(yǎng)時期，YXL1生長曲線較為平緩，表明YXL1菌株對高濃度重金屬培養(yǎng)液需要一個適應(yīng)過程，但11 h后開始迅速分裂繁殖，對Cd2+表現(xiàn)出極高的抗逆性和耐受性．

圖3 YXL1菌株在不同Cd2+質(zhì)量濃度下的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain YXL1 under different Cd2+ concentration stress

2.3 YXL1菌株可增強黑麥草對重金屬鎘的修復(fù)效果

土壤的pH值對Cd賦存形態(tài)具有決定性作用[22]．添加YXL1菌株后，土壤的pH值略微增高，但無顯著差異．YXL1對黑麥草修復(fù)Cd污染土壤效果的影響見表2. 由表2可知，與CK組相比，單獨施加YXL1時，土壤中有效磷的質(zhì)量濃度增加了1.04 mg/kg．與黑麥草聯(lián)合使用時，土壤有效磷的質(zhì)量濃度進一步增加，各處理組有效磷的質(zhì)量濃度分別為CK組的1.12、1.17和1.30倍，由此也驗證了YXL1菌株應(yīng)用在實際盆栽實驗中同樣具有較高的溶磷能力．此外，YXL1+黑麥草組中的有機質(zhì)質(zhì)量濃度顯著增加，高達25.05 g/kg，原因是添加YXL1后，土壤酶活性增強，進而土壤有機質(zhì)含量增加[23]．微生物與植物共同構(gòu)成土壤微生態(tài)系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)部相互影響、相互作用．在YXL1+黑麥草聯(lián)合體系中，重金屬賦存形態(tài)及黑麥草生物量均發(fā)生顯著變化． 與黑麥草對照組相比， YXL1+黑麥草的株高和干質(zhì)量分別為30.10 cm和1.67 g，分別增加17.12%和49.11%，由此印證了YXL1菌株對黑麥草生長具有顯著促進作用．YXL1增加了土壤中重金屬Cd的流動性，土壤中弱酸可提取態(tài)Cd和還原態(tài)Cd分別達到了16.25%和12.53%，提高了黑麥草對重金屬的富集能力．

由于黑麥草具有生長周期快，抗外界干擾能力強和耐寒等特點，常作為重金屬富集植物用于修復(fù)重金屬污染土壤．從表2可知，與黑麥草對照組相比，YXL1+黑麥草對植物中Cd的富集量達0.58 mg/kg，提高了2.76倍．若按照每平方米土地種植3 000株黑麥草、每年種植3季、耕作層為0～20 cm、土壤容重為1 100 kg/m3推算，春耕種植低積累作物，冬季休耕時種植黑麥草對土壤中重金屬Cd進行萃取，該礦區(qū)周邊農(nóng)用地耕作層重金屬Cd含量在4 a后可降低到《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 15618—2018)規(guī)定的風(fēng)險篩選值(0.3 mg/kg)以下，從而大大降低重金屬Cd對人體危害，實現(xiàn)礦區(qū)周邊重金屬污染農(nóng)用地的安全利用．

表2 YXL1對黑麥草修復(fù)Cd污染土壤效果的影響Table 2 Effect of strain YXL1 on remediation of Cd contaminated soil by ryegrass

3 結(jié) 論

1)通過重金屬壓力實驗以及促進菌篩選實驗，從污染礦區(qū)原土中篩選出一株具有較強促生能力且耐高質(zhì)量濃度重金屬鎘的植物促生菌(重金屬抗性菌)Burkholderiasp.YXL1．

2)YXL1與黑麥草聯(lián)合處理后，土壤有機質(zhì)和有效磷含量大幅度提升．與黑麥草單獨處理相比，YXL1能顯著增加黑麥草生物量，并能將重金屬從土壤中溶出，以提升黑麥草對Cd的富集能力．

3)將YXL1+黑麥草以間套種耕作方式處理重金屬鎘污染農(nóng)用地，測算4 a后土壤中Cd含量可降低到《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 15618—2018)規(guī)定的風(fēng)險篩選值(0.3 mg/kg)以下，表明YXL1可作為一種微生物修復(fù)材料修復(fù)Cd污染農(nóng)田且具有良好應(yīng)用前景．