張 穎，王 笛，張 培，張尊建，許風(fēng)國(guó)

（中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的疾病發(fā)生率和病死率［1］。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2020年全球新增結(jié)腸癌病例193萬(wàn)，死亡病例超過(guò)90萬(wàn)（https：//gco.iarc.fr/today/home）。流行病學(xué)研究表明糖尿?。?］、肥胖［3］等是結(jié)腸癌的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。胰島素［4］和脂肪酸代謝異常［5］可能是糖尿病和肥胖介導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)展的重要途徑。Chen等［4］研究發(fā)現(xiàn)胰島素可通過(guò)上調(diào)ACAT1的表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，而脂肪酸代謝異常（如油酸）可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤增殖及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤發(fā)生［6-7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胰島素和油酸聯(lián)用可以協(xié)同促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖和遷移。綜上，胰島素和油酸均可以在一定程度上促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，但二者對(duì)結(jié)腸癌代謝輪廓的影響尚不明確。因此，本研究從小分子代謝物角度出發(fā)，對(duì)胰島素和油酸給藥后HCT116細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠血清樣本進(jìn)行非目標(biāo)代謝組學(xué)研究，旨在尋找差異代謝物并為結(jié)腸癌的臨床診治提供理論參考。

1 材料

1.1 試劑及藥品

N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA，含量大于99.9%）、鹽酸甲氧胺（MOX，含量大于99.9%）及吡啶（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；甲醇、乙腈及乙酸乙酯（色譜純）（德國(guó)Merk公司）。精蛋白生物合成人胰島素注射液（預(yù)混30R）［諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司］；油酸（分析純，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

GC/MS-QP2010 Ultra氣質(zhì)聯(lián)用儀、UFLC-ITTOF/MS液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；CentriVap?離心濃縮儀（美國(guó)Labconco公司）；TMS-200恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）；5430R冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Milli-Q純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 細(xì)胞株及動(dòng)物

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116購(gòu)自南京宏新生物科技有限公司，經(jīng)上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司鑒定，樣品編號(hào)20191106-01。SPF級(jí)雄性BALB/c Nude裸鼠24只，5周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，操作規(guī)程符合動(dòng)物保護(hù)與使用要求，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2021-0011。

2 方法

2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

動(dòng)物自購(gòu)進(jìn)后于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)5～7 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，期間自由飲食，維持環(huán)境溫度為（24±2）℃以及12 h/12 h晝夜循環(huán)。

常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，并以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×107個(gè)，置于冰上備用。無(wú)菌條件下，采用1 mL注射器吸取HCT116細(xì)胞懸液0.2 mL注射于每只裸鼠腋窩皮下組織，注射完畢后，裸鼠自由飼養(yǎng)，待細(xì)胞定植后開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為對(duì)照組（CON）、胰島素單獨(dú)給藥組（INS）、油酸單獨(dú)給藥組（OA）、胰島素及油酸聯(lián)合給藥組（IO）。對(duì)照組給予空白溶媒；INS組給予胰島素；OA組給予油酸；IO組均同時(shí)給予胰島素和油酸。另外，為防止胰島素引起的低血糖，INS和IO組均給予10%葡萄糖水溶液替代飲水。胰島素以每日2.5 U/kg的劑量皮下注射方式給藥；油酸以每日2.0 g/kg的劑量灌胃給藥。首先進(jìn)行為期10 d的預(yù)給藥處理以營(yíng)造高胰島素和高油酸內(nèi)環(huán)境，模擬2型糖尿病病理環(huán)境。10 d預(yù)給藥結(jié)束后暫停給藥，于第11天皮下注射HCT116細(xì)胞，建立裸鼠移植瘤模型。隨后進(jìn)行為期6 d的細(xì)胞定植，待細(xì)胞定植成功且移植瘤生長(zhǎng)到體積為100 mm3左右時(shí)繼續(xù)給藥。對(duì)照組、INS組、OA組以及IO組給藥方式如前。待平均腫瘤體積達(dá)到1 000 mm3左右時(shí)處死動(dòng)物，取血清樣本進(jìn)行非目標(biāo)代謝組學(xué)分析。

2.3 非目標(biāo)代謝組學(xué)分析

2.3.1 樣品前處理

LC-MS樣品前處理：4℃解凍血清樣品，渦旋后取20μL，加入含5μg/mL格列本脲（內(nèi)標(biāo)）的乙腈溶液100μL沉淀蛋白，渦旋，4℃，14 000 r/min，離心10 min，吸取上清液，以相同的條件再次離心，取上清液于進(jìn)樣小瓶，待LC-MS分析。

GC-MS樣品前處理：4℃解凍血清樣品，渦旋后取10μL，加入含10μg/mL十七酸（內(nèi)標(biāo)）的甲醇溶液100μL，渦旋5 min，4℃，14 000 r/min離心2次，每次10min，取上清液80μL。在上清液中加入10 mg/mL MOX溶液25μL，渦旋1 min，37℃振蕩反應(yīng)1.5 h，50℃真空干燥2 h，加入MSTFA-乙酸乙酯（1∶4）溶液120μL，渦旋1 min，37℃振蕩反應(yīng)2 h，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，待GC-MS分析。

質(zhì)量控制樣本（QC）制備：從每份待測(cè)樣本中取相同體積血清，混勻，作為QC樣本。QC樣本前處理方式與其他待測(cè)樣本一致。儀器分析時(shí)，每4～6個(gè)待測(cè)樣本插入1個(gè)QC樣本，監(jiān)測(cè)儀器和分析方法的可靠性。

2.3.2 LC-MS及GC-MS分析

LC-MS分析：色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.4 mL/min；梯度洗脫（0～20 min，95%～5%A；20～23 min，5%A；23～30 min，95%A）；柱溫：40℃；進(jìn)樣器溫度：4℃；進(jìn)樣量：5μL。離子源為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；正、負(fù)離子模式同時(shí)采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1 000；檢測(cè)電壓：1.8 kV；離子源接口電壓：正極4.5 kV，負(fù)極-3.5 kV；加熱模塊（heat block）溫度：200℃；曲線脫溶劑管（CDL）溫度：200℃；霧化氣（氮?dú)猓┧俾剩?.5 L/min；干燥氣（氮?dú)猓毫Γ?70 kPa。

GC-MS分析：色譜柱為Restek?Rtx-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；程序升溫（0~2 min，70℃；2~27 min，70~320℃；27～29 min，320℃）；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣（99.999 6%氦氣）線速：36.7 cm/s；進(jìn)樣量：1μL（分流比20∶1）。電子轟擊離子源（electron impact ionization，EI）電壓：70 eV；離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時(shí)間：5 min；質(zhì)量掃描范圍：m/z45～600；采用全掃描模式采集數(shù)據(jù)。

2.3.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理及差異代謝物鑒定原始數(shù)據(jù)經(jīng)Profiling Solution軟件處理后導(dǎo)出，經(jīng)扣空白、缺失值填補(bǔ)、面積歸一化等數(shù)據(jù)前處理，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（princi?pal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projection to latent structures-dis?criminant analysis，OPLS-DA）。PCA得分圖用于觀察QC樣本的聚集程度。OPLS-DA模型用于兩組間差異離子篩選，模型中VIP>1的離子，需進(jìn)一步滿足Mann-Whitney U檢驗(yàn)P<0.05和|Fold Change|>1.5（FC，給藥組/空白組）。LC-MS差異離子經(jīng)文獻(xiàn)和HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)（The Human Metabo?lome Database，http：//www.hmdb.ca）比對(duì)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室代謝物庫(kù)進(jìn)行差異代謝物鑒定；GC-MS差異離子則通過(guò)NIST11.library及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鑒定。

3 結(jié) 果

3.1 胰島素和油酸對(duì)促進(jìn)裸鼠結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤增殖的影響

結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，胰島素和油酸同時(shí)給藥可以促進(jìn)裸鼠皮下移植瘤增殖。最后一次給藥結(jié)束后處死裸鼠，剝離瘤體，并對(duì)其重量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明IO組瘤體最重，與INS組及OA組存在顯著性差異（圖1-A）。另外裸鼠處死前各組體重測(cè)量結(jié)果表明，IO組裸鼠體重最低，且與CON組存在顯著性差異，而INS組及OA組與CON組體重?zé)o顯著差異（圖1-B），這一現(xiàn)象與腫瘤體重結(jié)果相符，說(shuō)明腫瘤的異常增殖導(dǎo)致裸鼠身形瘦弱且體重降低。

3.2 非目標(biāo)代謝組學(xué)方法驗(yàn)證

利用Profiling Solution軟件對(duì)GC-MS、LC-MS原始圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提?。▓D2），數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。LCMS和GC-MS裸鼠血清代謝輪廓譜PCA得分圖表示QC樣本聚集良好（圖3-A，圖3-C），且不同樣本中內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定，在正常范圍內(nèi)波動(dòng)（圖3-B，圖3-D），說(shuō)明儀器穩(wěn)定、方法和結(jié)果可重現(xiàn)度高。

3.3 差異代謝物篩選

3.3.1 胰島素和油酸單獨(dú)給藥差異代謝物篩選對(duì)LC-MS和GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，篩選滿足VIP>1、Mann-Whitney U檢驗(yàn)P<0.05和|FC|>1.5的離子進(jìn)行代謝物鑒定。結(jié)果顯示，INS組與OA組代謝輪廓和CON組相比，均未發(fā)生顯著改變，未篩選出符合條件的差異代謝物。IO組與OA（圖4-A，圖4-B）或INS組（圖4-C，圖4-D）相比，均呈現(xiàn)出一定程度的差異。其中，IO組與INS組相比，琥珀酸、谷氨酸、3-磷酸甘油及LysoPC（20∶3）含量顯著降低，膽固醇含量顯著升高（表1，圖5-A）；IO組與OA組相比，纈氨酸、尿素、異亮氨酸、膽固醇含量顯著升高，琥珀酸、LysoPC（20∶2）及L-乙酰肉堿含量顯著降低（表1，圖5-B）。以上結(jié)果表明，胰島素或油酸單獨(dú)給藥與二者聯(lián)合給藥對(duì)結(jié)腸癌血清代謝輪廓影響不同。

Figure 1 Tumor weight(A)and body weight(B)of nude mice following subcutaneous transplantation of colon carcinoma cell HCT116(xˉ±s,n=6)CON:Control;OA:Oleic acid(2.0 g/kg);INS:Insulin(2.5 U/kg);IO:Insulin(2.5 U/kg)plus oleic acid(2.0 g/kg)

Figure 2 Typical total ion chromatogram(TIC)of nude mice serum samples analyzed by LC-MS(ESI+)(A),LC-MS(ESI-)(B),and GC-MS(C)

Figure 3 3-Dimensional PCA score plots from(A)LC-MSand(C)GC-MSdata;and peak area of internal standard in all samples from(B)LC-MS and(D)GC-MSdata

3.3.2 胰島素和油酸聯(lián)合給藥差異代謝物篩選LC-MS和GC-MS分析結(jié)果表明IO組與CON組存在較為顯著的組間差異（圖4-E，圖4-F）。胰島素及油酸聯(lián)合給藥使裸鼠體內(nèi)阿拉伯糖、鞘氨醇及L-乙酰肉堿含量顯著降低，而尿素及膽固醇含量升高（表1，圖5-C），揭示二者聯(lián)用擾亂了機(jī)體原有的代謝平衡狀態(tài)，引起代謝失調(diào)紊亂。尿素是體內(nèi)氨基酸代謝產(chǎn)物，而鞘氨醇、L-乙酰肉堿和膽固醇是脂類(lèi)代謝相關(guān)物質(zhì)，因此，推測(cè)胰島素和油酸聯(lián)用引起糖脂代謝及氨基酸代謝異常，從而對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。

Figure 4 OPLS-DA scoreplots from LC-MSdata(A,C,E)and OPLS-DA scoreplots based on GC-MSdata（B,D,F）

4 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)給予HCT116細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠胰島素和油酸，血清中膽固醇含量顯著提高。膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜組成以及維持膜完整性和流動(dòng)性的主要脂類(lèi)成分之一［8］，已有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇異常代謝在一定程度上為腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)［9］。還有研究揭示，膽固醇可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-33a-PIM3途徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，并抑制細(xì)胞凋亡［10］，在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在前列腺癌研究中，膽固醇氧化代謝產(chǎn)物27-羥基膽固醇則可以通過(guò)刺激雌激素受體β促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖［11］。另外，膽固醇可以通過(guò)激活LXRα/β促進(jìn)卵巢癌化學(xué)耐藥的發(fā)生［12］，從而影響化療效果。因此，靶向膽固醇合成代謝通路相關(guān)蛋白進(jìn)行藥物干預(yù)有望成為腫瘤治療的新手段［13］。

Figure5 Histogramsof relativecontent in nudemiceof differential metabolitesscreened fromdifferent comparisons

Table1 Differential metabolites in serum of nudemice after administration

此外，本研究發(fā)現(xiàn)另一種參與體內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)L-乙酰肉堿，在IO組含量顯著下調(diào)，提示體內(nèi)L-乙酰肉堿水平可能與腫瘤惡化程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。有研究證實(shí)，飲食補(bǔ)充肉堿和乙酰肉堿可以減輕小鼠DSS結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的嚴(yán)重程度［14］。研究人員發(fā)現(xiàn)乙酰肉堿可以增強(qiáng)丁酸鹽的抗結(jié)腸癌效果［15］。并且，L-乙酰肉堿還表現(xiàn)出抗腫瘤血管生成的作用［16］。以上研究結(jié)果說(shuō)明胰島素和油酸所引起的結(jié)腸癌小鼠代謝紊亂與腫瘤惡化具有一定相關(guān)性，提示異常的代謝物水平可以作為臨床腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的依據(jù)，對(duì)疾病的早期診斷具有指導(dǎo)意義。

糖尿病、肥胖等疾病是腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)因素［17］，特殊的病理環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)存在較大的影響。已有研究發(fā)現(xiàn)亞油酸預(yù)處理可以提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞對(duì)胰島素的應(yīng)答［18］，說(shuō)明在高亞油酸環(huán)境中，胰島素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性表型的作用顯著提高，證明環(huán)境因素在腫瘤進(jìn)程中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)給予荷瘤鼠油酸及胰島素時(shí)，其體內(nèi)代謝輪廓發(fā)生變化，而胰島素和油酸單獨(dú)給藥并未造成顯著的代謝改變，說(shuō)明二者同時(shí)存在才會(huì)對(duì)結(jié)腸癌的代謝產(chǎn)生較為重要的影響，油酸及胰島素對(duì)結(jié)腸癌代謝輪廓的調(diào)節(jié)具有條件依賴(lài)性。因此，對(duì)于臨床結(jié)腸癌患者，在其診斷過(guò)程中應(yīng)充分了解患者的疾病史以及飲食偏好等，若其本身同時(shí)患有高胰島素血癥或出現(xiàn)體內(nèi)胰島素過(guò)度分泌的情況，應(yīng)當(dāng)注意飲食，降低含油酸較高的食物的攝入，盡量選擇低脂飲食，從而避免因機(jī)體代謝紊亂而加重腫瘤發(fā)展。

本研究建立了結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116皮下移植瘤模型，對(duì)胰島素及油酸給藥后的荷瘤鼠血液樣本進(jìn)行非目標(biāo)代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)胰島素和油酸聯(lián)合給藥促進(jìn)了結(jié)腸癌發(fā)展，擾動(dòng)了血清代謝物輪廓，相關(guān)結(jié)果為進(jìn)一步研究糖尿患者結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也可為結(jié)腸癌患者的臨床診斷和治療提供參考。