王凱振,楊婉婉,徐晟瑤,郭青龍,趙 麗
(中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院,南京210009)
乳腺癌(breast cancer,BC)是女性中最常見的腫瘤[1-2]。其治療方案包括手術(shù)切除、化療、放療和聯(lián)合治療[3]?;煹哪退幮砸恢笔抢_BC患者臨床治療的難題[4]。阿霉素(doxorubicin,DOX)是被廣泛使用的一線化療藥物,可以顯著降低乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和病死率[5]。但是,乳腺癌患者在化療過程中會(huì)對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)細(xì)胞暴露于累積劑量的阿霉素時(shí),細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥表型,而且阿霉素耐藥細(xì)胞通常也會(huì)對(duì)其他化療藥物表現(xiàn)出顯著的交叉耐藥[6]。
AKR1C3是醛酮還原酶家族(aldo-keto reduc?tases,AKRs)的一員,是體內(nèi)類固醇代謝的關(guān)鍵酶,AKR1C3異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致類固醇代謝紊亂,從而引起各種疾病。AKR1C3參與了體內(nèi)性激素的合成,在性激素依賴性的疾病中起著舉足輕重的作用。它可以作用于雄激素受體(AR)、雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)來調(diào)節(jié)雄激素、雌激素和孕激素的含量[7]。近年來,AKR1C3在多種腫瘤中的促癌作用已被證實(shí)[8-9],但在乳腺癌發(fā)生與發(fā)展中的作用及作用機(jī)制卻存在爭議[9]。為進(jìn)一步研究AKR1C3在乳腺癌耐藥中的作用和內(nèi)在機(jī)制,本研究構(gòu)建了乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株及AKR1C3高表達(dá)和敲低細(xì)胞株,以此為研究對(duì)象,揭示其對(duì)阿霉素耐藥的介導(dǎo)作用,為臨床乳腺癌的治療提供新思路與方法。
阿霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);DMEM培養(yǎng)基,RPMI 1640培養(yǎng)基,胎牛血清(FBS)及0.25%胰蛋白酶溶液(美國Gibco公司);β-catenin特異性抑制劑XAV939(上?;偕锟萍加邢薰荆秽堰拭顾兀o錫納奧生物醫(yī)藥有限公司);AKR1C3過表達(dá)質(zhì)粒OE(北京安諾倫生物科技有限公司);AKR1C3敲低質(zhì)粒shRNAAKR1C3(蘇州吉瑪基因股份有限公司);質(zhì)粒提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒(上海翊圣生物技術(shù)股份有限公司);DAPI染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司);核漿分離試劑盒(南京凱基生物技術(shù)股份有限公司);Bcl-2,Bax一抗(武漢Abclonal公司);AKR1C3(英國Abcam公司);Wnt3a,p-GSK-3β,β-catenin,LaminA/C,β-actin一抗(武漢protein?tech公司);HRP山羊抗兔IgG和HRP山羊抗鼠IgG(武漢Abclonal公司)。其余試劑均為市售分析純。
正置熒光顯微鏡(德國Leica公司);化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能科技有限公司);多功能酶標(biāo)儀,PCR擴(kuò)增儀(美國Thermo公司)。
人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)。
將MCF-7細(xì)胞接種于含10%FBS,1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3天傳代1次,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
采用濃度梯度遞增法[10],建立阿霉素乳腺癌MCF-7耐藥細(xì)胞系并命名為MCF-7/DOX。首先,在無菌避光條件下稱取一定量的阿霉素固體粉末于EP管中,加入無菌水,避光超聲使之充分溶解,使母液濃度為10 mmol/L,過濾除菌后于-20℃避光保存。然后,將接種的MCF-7細(xì)胞在0.5μmol/L阿霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),洗掉死亡細(xì)胞,穩(wěn)定細(xì)胞后增加阿霉素藥物劑量,逐步篩選,最終得到的耐藥細(xì)胞株命名為MCF-7/DOX。
將AKR1C3過表達(dá)質(zhì)粒OE和AKR1C3敲低質(zhì)粒shRNA-AKR1C3用慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,收集病毒上清液,過濾分裝于-80℃保存。用病毒上清液侵染MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞,然后用2μmol/L嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選兩周后,選出一個(gè)穩(wěn)定生長的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng),最終得到穩(wěn)定高表達(dá)AKR1C3的MCF-7細(xì)胞株(MCF-7/AKR1C3)和穩(wěn)定低表達(dá)AKR1C3的MCF-7/DOX的細(xì)胞株(MCF-7/DOX-KD)。
取對(duì)數(shù)期生長狀態(tài)良好的MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞,消化后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板上,24 h后,加入含有不同濃度的阿霉素的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后,每孔加入CCK-8溶液10μL,37℃孵育1 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸收度,計(jì)算細(xì)胞活力,實(shí)驗(yàn)平行測定3次。耐藥指數(shù)(RI[10])=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。
取對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞,消化后以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在提前放置好玻片的6孔板中,待細(xì)胞爬片穩(wěn)定后加入不同濃度含有阿霉素的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,取出細(xì)胞爬片按照DAPI染色試劑盒操作進(jìn)行染色,最后用熒光顯微鏡拍照觀察凋亡情況。
將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞置于6孔板中,每孔1 000個(gè)細(xì)胞,用阿霉素處理后培養(yǎng)12~14 d。存活細(xì)胞克隆用4%甲醛固定20 min后,用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,沖洗干凈晾干后進(jìn)行拍照觀察細(xì)胞增殖情況。
將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD的細(xì)胞,消化后以每孔6×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板上,培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%以上,收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞蛋白,BCA蛋白定量法測定細(xì)胞蛋白濃度,在樣品中加入4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液使用100℃金屬浴加熱10 min進(jìn)行蛋白變性;進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠:90 V,30 min;分離膠120 V,90 min),電泳后轉(zhuǎn)膜2 h至硝酸纖維素膜(NC膜)上,使用5%脫脂奶粉溶液封閉60 min;一 抗(β-actin、LaminA/C、β-tubulin、AKR1C3、Wnt3a、p-GSK-3β、β-catenin、Bax、Bcl-2,1∶1 000)4℃孵育過夜;使用PBST清洗3次,每次10 min,加入HRP山羊抗兔IgG和HRP山羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)搖動(dòng)孵育1 h;PBST清洗3次,使用蛋白成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。
將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD的細(xì)胞均勻接種在6孔板上,培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%以上。收集細(xì)胞,使用Trizol法提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,加入SYBR Green,使用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:95℃15 s,60℃1 min,95℃1 min,65℃10 s,一共35個(gè)循環(huán)。采用GAP?DH作為內(nèi)參,所用引物序列如表1。
將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD細(xì)胞,消化后以每孔6×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板上,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%以上。收集細(xì)胞,用核漿分離試劑盒提取與分離核漿蛋白,得到蛋白樣品后按照“2.7”項(xiàng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
取對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD細(xì)胞,接種于提前放置好玻片的6孔板上,加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后取出6孔板。用PBS洗3次,每次5 min。4%多聚甲醛固定5 min后,加入0.3%Triton反應(yīng)5~15 min,PBS洗3次,每次5 min。然后,加入3%BSA封閉2 h;PBS洗3次,每次5 min。加入βcatenin一抗80~100μL(1∶100)后,置于37℃,1 h后,4℃過夜。然后,PBST洗3次,每次5 min。避光,加入HRP山羊抗兔IgG二抗溶液,常溫反應(yīng)30~40 min,PBST洗4次,每次5 min。最后,加入含抗熒光淬滅劑的DAPI封片液進(jìn)行封片;封片后,在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,結(jié)果以xˉ±s表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
本研究采用濃度梯度遞增法,成功建立了對(duì)阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/DOX。用CCK-8細(xì)胞藥物敏感實(shí)驗(yàn),檢測到阿霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50為(2.865±0.042 13)μmol/L,而對(duì)MCF-7/DOX細(xì)胞的IC50為(171.0±0.027 23)μmol/L(圖1-A,圖1-B)。MCF-7/DOX細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)(RI)約為60倍。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證耐藥細(xì)胞株MCF-7/DOX對(duì)阿霉素的耐藥性,用DAPI染色檢測凋亡細(xì)胞情況。如圖1-C所示,1.0、2.0μmol/L阿霉素處理對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞24 h后,相比于耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX,敏感株細(xì)胞MCF-7可以明顯觀察到核質(zhì)濃縮,核膜核仁破碎,大小不一內(nèi)含核碎片的凋亡小體,表示細(xì)胞發(fā)生更多的凋亡。
Figure 1 Effects of different concentrations of doxorubicin(DOX)on cell viability and apoptosis in MCF-7 and doxorubicin-resistant cell line MCF-7/DOX(xˉ±s,n=3)
已有報(bào)道表明,在乳腺癌細(xì)胞中AKR1C3的表達(dá)水平較正常乳腺細(xì)胞中高[8],而且AKR1C3的上調(diào)常常與不良預(yù)后有關(guān)[11]。在本研究中,Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DOX中,AKR1C3的表達(dá)水平較敏感株乳腺癌細(xì)胞MCF-7明顯升高(圖2-A)。同時(shí),QRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,耐藥細(xì)胞株MCF-7/DOX中,AKR1C3水平升高了約251.3倍(圖2-B)。上述結(jié)果表明,在乳腺癌耐藥細(xì)胞中,AKR1C3表達(dá)水平上調(diào)可能與阿霉素耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。
為了進(jìn)一步研究AKR1C3在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用,本研究在MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)AKR1C3蛋白,構(gòu)建過表達(dá)細(xì)胞株MCF-7/AKR1C3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過表達(dá)細(xì)胞株MCF-7/AKR1C3中AKR1C3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(圖3-A),AKR1C3的mRNA水平提高了157倍(圖3-B)。
本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MCF-7/AKR1C3細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。結(jié)果顯示,阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3和MCF-7細(xì)胞的IC50分別為(14.460±0.043)μmol/L和(2.425±0.034)μmol/L。MCF-7/AKR1C3細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)(RI)約為6(圖3-C)。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1μmol/L和2μmol/L的阿霉素對(duì)于MCF-7/AKR1C3細(xì)胞的集落形成能力幾乎無影響,卻可以顯著地抑制MCF-7細(xì)胞的集落形成(圖3-D)。DAPI染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn),阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3細(xì)胞凋亡幾乎無影響,而低濃度的阿霉素卻可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生明顯的核膜核仁破碎,染色質(zhì)固縮成新月形聚集,凋亡小體形成,細(xì)胞發(fā)生更多的凋亡(圖3-E)。
Figure 2 Expression of AKR1C3 in MCF-7 and MCF-7/DOX cells(xˉ±s,n=3)
為了進(jìn)一步確證AKR1C3介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞耐藥的作用,本研究構(gòu)建了敲低MCF-7/DOX的AKR1C3的細(xì)胞株MCF-7/DOX-KD,并檢測了其對(duì)阿霉素的敏感性(圖3-F,3-G),CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,阿霉素對(duì)MCF-7/DOX和MCF-7/DOX-KD細(xì)胞的IC50分別為(186.5±0.021 17)μmol/L和(95.16±0.036 46)μmol/L,降低了約50%(圖3-H)。
以上結(jié)果表明,過表達(dá)AKR1C3可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性,低表達(dá)AKR1C3會(huì)增加細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性,證實(shí)了AKR1C3在乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥中具有介導(dǎo)作用。
有報(bào)道稱β-catenin與許多腫瘤的耐藥性密切相關(guān)[12-13]。為了研究AKR1C3介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥與β-catenin的關(guān)聯(lián)性,本研究檢測了在AKR1C3高表達(dá)細(xì)胞MCF-7/AKR1C3中Wnt/βcatenin通路蛋白表達(dá)情況。如圖4-A所示,Wnt3a和p-GSK-3β均高表達(dá),說明MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中該通路被激活。核漿分離結(jié)果發(fā)現(xiàn),MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中胞質(zhì)β-catenin含量減少,核內(nèi)表達(dá)增多(圖4-B),同時(shí)免疫熒光結(jié)果也印證MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中β-catenin入核增多(圖4-C)。
在敲低AKR1C3之后,免疫熒光結(jié)果表明胞質(zhì)β-catenin含量增多,核內(nèi)表達(dá)減少(圖4-D),這與Western blot結(jié)果中的Wnt/β-catenin通路受到抑制,核內(nèi)β-catenin含量減少一致(圖4-E,4-F)。以上結(jié)果表明,β-catenin可能參與了AKR1C3對(duì)乳腺癌細(xì)胞阿霉素的介導(dǎo)作用。
為了進(jìn)一步確證β-catenin在AKR1C3誘導(dǎo)的阿霉素耐藥中的作用,本研究使用β-catenin特異性抑制劑XAV939來抑制胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平。結(jié)果表明,XAV939不僅會(huì)抑制β-catenin總蛋白水平,也會(huì)其降低核內(nèi)的表達(dá)水平(圖5-A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10μmol/L XAV939與阿霉素聯(lián)用能顯著提高阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3乳腺癌細(xì)胞的抑制率(IC50=5.340±0.065μmol/L),與單用阿霉素相比IC50降低了約70%(圖5-B)。同時(shí),凋亡相關(guān)蛋白的檢測也發(fā)現(xiàn)XAV939能顯著提高阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中凋亡蛋白Bax的表達(dá),并減低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(圖5-C)。以上結(jié)果說明,AKR1C3誘導(dǎo)的阿霉素耐藥部分由β-catenin通路介導(dǎo)。
本研究探討了AKR1C3/β-catenin軸在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用,證明了AKR1C3可能通過Wnt/β-catenin介導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞的阿霉素耐藥。關(guān)于AKR1C3參與乳腺癌阿霉素耐藥雖然已有報(bào)道,但大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為,AKR1C3是作為氧化還原酶,將阿霉素還原成低毒性的阿霉素醇,從而降低了阿霉素的毒性作用。本研究主要探討AKR1C3在生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用,旨在闡明其酶活之外的阿霉素耐藥的介導(dǎo)作用。
Figure 3 Effect of AKR1C3 on thesensitivity of DOX in MCF-7 cells(xˉ±s,n=3)
Figure 4 Effect of AKR1C3 on the Wnt/β-catenin pathway in MCF-7 and MCF-7/DOX cells(xˉ±s,n=3)
本研究發(fā)現(xiàn)AKR1C3在阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。AKR1C3基因過表達(dá)或敲低可增強(qiáng)或抑制乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性,這反映在細(xì)胞活力、集落形成能力和凋亡的結(jié)果上。深入研究發(fā)現(xiàn),AKR1C3誘導(dǎo)的阿霉素耐藥性可能與βcatenin信號(hào)通路相關(guān)。過表達(dá)的AKR1C3促進(jìn)βcatenin的入核,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞集落形成能力,增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性;敲低AKR1C3減少β-catenin的核轉(zhuǎn)位,降低乳腺癌細(xì)胞活力,減弱癌細(xì)胞的耐藥性。然而,相比于敏感株細(xì)胞MCF-7,即使敲低AKR1C3的細(xì)胞株MCF-7/DOX-KD對(duì)阿霉素的敏感性仍然較低,提示在阿霉素耐藥過程中,除AKR1C3之外,還有其他通路影響耐藥細(xì)胞的敏感性,具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。XAV939是一種有效的端錨聚合酶(TNKS)1和2小分子抑制劑,通過抑制TNKS活性,增加腫瘤細(xì)胞中Axin-GSK3β復(fù)合物的蛋白水平,并促進(jìn)β-catenin的降解[14]。當(dāng)用XAV939處理MCF-7阿霉素耐藥細(xì)胞之后,β-catenin核內(nèi)含量降低,增強(qiáng)阿霉素對(duì)MCF-7/DOX的凋亡誘導(dǎo)作用。但AKR1C3是如何調(diào)控β-catenin的核內(nèi)表達(dá)水平,以及β-catenin是如何發(fā)揮其耐藥作用仍需進(jìn)一步的研究。已有研究報(bào)道,芳香烴受體(AhR)可增強(qiáng)三陰性乳腺癌中AKR1C3啟動(dòng)子活性,調(diào)控AKR1C3的表達(dá)進(jìn)而影響對(duì)阿霉素的敏感性[11]。也有報(bào)道AhR可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的特征[15]。那么,AhR是否通過影響AKR1C3介導(dǎo)的β-catenin入核來調(diào)控乳腺癌阿霉素耐藥,有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,在阿霉素耐藥乳腺癌MCF-7細(xì)胞模型中,AKR1C3/β-catenin是阿霉素耐藥的原因之一,靶向AKR1C3/β-catenin在乳腺癌阿霉素耐藥的治療中可能具有良好的應(yīng)用前景。
Figure 5 Effects ofβ-catenin inhibitor XAV939 combined with DOX on the cell viability and apoptosis in MCF-7 and MCF-7/AKR1C3 cells(xˉ±s,n=3)