某豬場豬繁殖與呼吸綜合征分析

文│賈義平 李翠玲 樊祜卿（山東省菏澤市動物疫病預(yù)防控制中心）

趙魯菏（山東省菏澤市行政審批踏勘評審中心）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病。該病具有持續(xù)性感染的特征，豬群一旦感染該病，PRRSV將長時間存在于豬群中，引起母豬妊娠后期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等生殖障礙和新生及斷奶仔豬咳嗽、呼吸困難等呼吸癥狀。1996年，郭寶清等首次分離出我國PRRSV CH1-a毒株，隨后我國各地均有PRRSV的檢出，嚴(yán)重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，給各地養(yǎng)殖場戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

防控PRRS重在接種疫苗達(dá)到免疫保護(hù)的效果，但PRRS核苷酸及氨基酸序列極易發(fā)生變異、重組，影響病毒的抗原性和致病力，尤其是PRRSV-ORF5基因變異頻率最高，造成多個譜系的流行，從而導(dǎo)致現(xiàn)有的商品化疫苗免疫效果不佳甚至免疫失敗，給防控PRRS帶來困難。本研究通過對山東菏澤某規(guī)?；i場開展PRRS血清流行病學(xué)調(diào)查以及對疑似患PRRS豬的肺和流產(chǎn)胎兒胎衣進(jìn)行病毒RNA的提取，RT-PCR擴(kuò)增PRRSV-ORF5，選取陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，與PRRSV代表毒株的序列進(jìn)行比較，給當(dāng)?shù)匾呙邕x擇提供理論基礎(chǔ)，為當(dāng)?shù)卦摬〉姆揽靥峁﹨⒖家罁?jù)。

一、材料與方法

1.發(fā)病豬場概況。山東省菏澤市2000頭一點(diǎn)式自繁自養(yǎng)場，配種、產(chǎn)房、保育、育肥各棟舍間距離較遠(yuǎn)，中間無實(shí)體圍墻隔離。豬場圈舍設(shè)計(jì)為余氏豬場設(shè)計(jì)，豬舍溫控全部采用全自動控制，鋪設(shè)有地暖。采用4周批的批次化生產(chǎn)模式。130～150日齡育肥豬厭食、精神沉郁、呼吸困難、日增重不同程度減少，發(fā)病率30%左右，死亡率約4%；母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎現(xiàn)象，而后陸續(xù)轉(zhuǎn)到仔豬和保育舍。該場使用的疫苗毒株為某公司生產(chǎn)的CH1-R毒株疫苗，免疫程序?yàn)樯唐坟i21日齡肌內(nèi)注射免疫，后備豬21日齡和145日齡肌內(nèi)注射免疫，種豬普免2次/年。

2.樣品采集。采集疑似PRRS的豬肺和流產(chǎn)胎兒胎衣共6份樣品，置-80℃保存?zhèn)溆谩Ｇ扒混o脈采集表面健康豬只血液5～8毫升，自然靜置2小時凝固，析出血清，共采集240份（其中待配35份、妊娠35份、后備35份、仔豬50份、保育45份、育肥40份），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.主要試劑及儀器。天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，cador pathogen 96 QIAcube HT Kit，DNA擴(kuò)增試劑2×Taq Master Mix（Dye Plus），RNA擴(kuò)增試劑Primerscript one step RT-PCR Kit購自天根生化科技有限公司，藍(lán)耳病毒抗體ELISA試劑盒（國產(chǎn)）購自科前生物，東勝基因擴(kuò)增儀，酶標(biāo)儀Thermo Fisher。

4.檢測方法。樣品檢測方法及結(jié)果判定參照試劑盒說明書。

5.序列及數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用DNA Star軟件對ORF5基因序列與GeneBank上收錄的PRRSV-ORF5基因序列進(jìn)行同源性分析，并繪制進(jìn)化樹。PRRSV參考毒株為R98、CH1-a、CH1-R、VR2332、GD2008、HUN4、JXA1-P80、TJ-M、NADC30、JL580、GM2、GD-ZQ-2014。使用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

二、結(jié)果

1.PRSSV-ORF5基因的擴(kuò)增結(jié)果。用PRRSV ORF5基因特異性引物對采集的6份疑似PRRS樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)檢測共4份病料為陽性，擴(kuò)增出大小為447bp的ORF5基因片段，編號分別為SD-HZCW1（2泳道）、SD-HZCW2（4泳道）、SD-HZCW3（5泳道）、SD-HZCW4（6泳道）。結(jié)果見圖1。

◎圖1 PRRSV ORF5基因擴(kuò)增結(jié)果

2.PRSSV-ORF5基因序列分析。選取2個陽性樣品（SDHZCW3、SD-HZCW4）進(jìn)行PRRSVORF5基因測序。結(jié)果表明，所測2株核苷酸序列同源性為100%。與國內(nèi)外已發(fā)表的參考毒株ORF5基因序列進(jìn)行同源性對比（見表1），結(jié)果表明，所測樣品的ORF5基因與國內(nèi)外已報(bào)道毒株的基因序列同源性為82.5%～99.5%。其中與R98同源性最高為99.5%，與GM2同源性最低為82.5%。

表1 PRRSV-ORF5基因同源性分析%

3.遺傳進(jìn)化樹分析。運(yùn)用DNAstar軟件，將樣品SD-HZCW3的ORF5基因序列與國內(nèi)外參考毒株序列進(jìn)行比對，繪制遺傳進(jìn)化關(guān)系圖（見圖2）。通過比較發(fā)現(xiàn)，與VR2332為代表的譜系5（亞系5.1）的親緣關(guān)系較近。

◎圖2 PRRSV ORF5基因核酸遺傳進(jìn)化樹

4.不同豬群抗體檢測結(jié)果。該場共檢測血清樣本240份，總體血清抗體陽性率為81.18%。其中，抗體陽性率，育肥豬最高為96%，其次是后備母豬為93.52%，仔豬最低為54.22%。血清抗體S/P值，育肥豬最高為2.1，其次是后備母豬為1.78，仔豬最低為1.18。血清抗體離散度，育肥豬最低為25.29%，其次是后備豬為33.48%，仔豬最高為50.26%。

三、分析與討論

PRRSV主要分為兩個基因型，分別以基因1型（Lelystad病毒）和基因2型（VR2332）為代表，1型主要分布在歐洲，2型主要分布在北美洲和亞洲。其中，亞洲2型PRRSV的出現(xiàn)主要是由北美譜系的引入導(dǎo)致，該譜系在我國發(fā)生多樣性變異，進(jìn)而導(dǎo)致該病的暴發(fā)和毒力增強(qiáng)。自1996年首次報(bào)道PRRSV以來，我國PRRS的流行主要分為兩個階段，到2006年Tian T等分離出高致病性PRRSV之前為傳統(tǒng)PRRS流行階段，之后我國開始進(jìn)入豬PRRS暴發(fā)時期，高致病性PRRSV成為我國流行的主要毒株。

Guo等發(fā)現(xiàn)我國流行的PRRSV美洲型分為4個譜系，分別是以類NADC30為代表的譜系1，以GM2/QYYZ為代表的譜系3，以BJ-4/VR2332為代表的譜系5（亞系5.1）和以CH-1a like/JXA1-like為代表的譜系8（亞系8.1/亞系8.7）。在2013——2018年對山東省及周邊地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組遺傳進(jìn)化分析研究中共分離出20份毒株，其中13株為高致病性變異毒株，屬于亞系8.7；1株與CH-1a處于同一分支，屬于亞系8.1，6株與VR2332位于同一分支，屬于亞系5.1。本研究分析，該場毒株與經(jīng)典毒株R98的同源性最高為99.5%，屬于亞系5.1，其次為同一譜系的參考毒株VR2332，同源性為99.0%。另外，與經(jīng)典PVVSV疫苗毒株CH1-R的同源性為90.5%，與變異毒株GD2008、HUN4、JXA1-P80、TJ-M、GD-ZQ-2014的同源性為87%～87.5%，與JL580、NADC30的同源性分別為86%、86.3%，與重組毒株GM2的同源性最低為82.5%。

接種PRRSV疫苗能夠產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，減輕臨床癥狀和減少病毒排泄量。但本研究發(fā)現(xiàn)，該場母豬群血清抗體陽性率為87.05%，離散度偏高為44.21%，抗體整齊度較差，尤其妊娠母豬離散度達(dá)到50%以上。這可能與該場使用的疫苗毒株同源性不高，疫苗難以做到有效保護(hù)有關(guān)。Chung等研究發(fā)現(xiàn)，仔豬、斷奶豬感染PRRSV與母源抗體的減少有關(guān)。本研究檢測結(jié)果顯示，仔豬和斷奶豬血清抗體陽性率為僅為57.80%，這可能是由于仔豬、斷奶豬受到持續(xù)感染、母源抗體保護(hù)的時間減少，導(dǎo)致對仔豬的保護(hù)下降。

根據(jù)張東成等對發(fā)病豬群的3次（前驅(qū)期、明顯期、轉(zhuǎn)歸期）ELISA抗體水平檢測，發(fā)現(xiàn)可以根據(jù)S/P值來判定感染豬群是活躍豬群，還是穩(wěn)定豬群（轉(zhuǎn)歸期及以后）。該場育肥豬血清抗體陽性率為96%，而S/P值在2.0以上，可以推測該場育肥豬群為感染PRRSV的活躍豬群。當(dāng)育肥活躍豬群感染PRRSV后，仔豬和保育豬免疫保護(hù)水平不足，開始感染，繼而出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、厭食、被毛粗亂、共濟(jì)失調(diào)等癥狀，母豬群出現(xiàn)不同程度的流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等繁殖障礙疾病。

本研究揭示了該場流行的毒株與R98同源性最高，與VR2332處于同一分支，屬于亞系5.1，與疫苗毒株CH1-R同源性偏低，豬群抗體水平偏低，保護(hù)力不足，需要通過選擇同源性高的疫苗毒株，并加強(qiáng)生物安全控制進(jìn)行系統(tǒng)性防控。