林華城，劉海琴，馬華根，唐元瑜

（1福建中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院；2福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院；3福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福州350122）

視網膜微血管，主要是由一層單層扁平上皮細胞構成，其調節(jié)血壓功能和屏障功能容易受到心[1]、腦[2]、腎[3]或血液循環(huán)等[4]病變的影響而發(fā)生管壁形態(tài)改變以及滲出、出血、新生血管增生等病變[5]。視網膜血管病變危害性大，具有致盲性，近年來其發(fā)病率不斷升高，如何延緩視網膜血管病變的發(fā)展進程，已成為臨床醫(yī)生及醫(yī)學科研人員亟需攻克的難題[6，7]。視網膜微血管內皮細胞（retinal microvascular endothelial cells，RVECs）是構建視網膜血管病理模型的重要工具細胞之一。由于人的視網膜獲取途徑較少，因此與人高度同源的大鼠視網膜血管內皮細胞便成為了目前研究視網膜血管病變最廣泛的選擇。本研究擬建立一種高效、簡易、細胞獲取量多、純度高的大鼠RVECs培養(yǎng)方法，為后續(xù)視網膜血管疾病的研究奠定重要的細胞生物學實驗基礎。

材料和方法

1 實驗動物

6～8周齡的SPF級Sprague-Dawley大鼠5只，雌雄不拘。購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心，動物質量合格證號SCXK（閩）2016-0002。

2 主要試劑及儀器

胎牛血清（美國Gibco公司）；肝素鈉（南京新百藥業(yè)有限公司）；Ⅱ型膠原酶（北京鼎國生物公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（南京凱基生物公司）；即用型SA1022—兔IgG/SABC免疫組織化學染色試劑盒、兔抗大鼠VIII因子相關抗原抗體、DAB顯色劑（武漢博士德生物公司）。超凈工作臺（蘇凈集團安泰空氣技術有限公司）；低速離心機（中國湖南湘儀公司）；倒置生物顯微鏡（德國Leica公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

3 大鼠RVECs的原代培養(yǎng)

在動物實驗中心，將受試大鼠頸椎脫臼處死，固定于解剖臺上，常規(guī)眼部消毒后，拉緊頸部皮膚，使眼球突出于眼瞼。用彎鑷夾持視神經根部，將眼球向上托起，摘取眼球，迅速置于無菌離心管內，帶回細胞室。

在超凈臺中，將眼球附屬的細線狀視神經根、眼球外肌肉以及筋膜等輕輕剝離。用預冷PBS溶液漂洗修整過的“clear eye”眼球3次后，用兩把眼科彎鑷配合，輕輕擠壓眼球四周，然后用虹膜剪在角膜緣后0.2mm處環(huán)形剪一周，將角膜、虹膜、睫狀體和晶狀體一并去除，并擠壓眼球，去除玻璃體；翻轉眼球壁，用顯微剪剪斷視網膜與視盤粘連處，使視網膜脫落、游離，并用鈍頭吸管將其轉移至離心管中。

用預冷的PBS溶液反復吹打、漂洗視網膜后，將其剪碎至肉泥狀，依次通過200μm、75μm不銹鋼標準篩網；收集篩網下濾液，將其轉移至15ml離心管中，離心，棄上清，向管內滴加10ml 0.1%II型膠原酶溶液，37 ℃消化15～20min；輕輕吹打后，再次通過45μm尼龍篩網；翻轉篩網，將其倒扣在培養(yǎng)皿中，沖洗篩網，將沖洗液全部轉移至15ml離心管內，輕緩吹打后，離心，棄上清，加入含25%胎牛血清、胰島素、肝素、L-谷氨酰胺的M199完全培養(yǎng)液，混勻后接種于1%明膠包被的Nunc培養(yǎng)皿中，輕緩作十字形晃動，靜置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后半量更換新鮮培養(yǎng)液。

4 大鼠RVECs的傳代培養(yǎng)

待大鼠RVECs進入對數生長期，細胞融合度接近85%～90%時，吸棄舊培養(yǎng)液，用37℃預熱的PBS溶液漂洗2遍后，加入4ml 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液，室溫消化2～3min。鏡下觀察到大部分細胞圓縮、開始脫壁時，加入4ml完全培養(yǎng)液終止消化，輕緩吹打瓶壁以進一步促進細胞脫落；離心，棄上清液，將細胞沉淀與6ml培養(yǎng)液吹打混勻后，以1:2的傳代比例接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

5 倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況

在不同時間點，將接種有原代和第一代傳代大鼠RVECs的培養(yǎng)皿置于倒置相差顯微鏡下，觀察細胞的形態(tài)、貼壁、密度及融合度等生長情況，并拍照記錄。

6 免疫細胞化學染色法檢測VIII因子相關抗原

將原代大鼠RVECs消化成單細胞懸液后，接種于培養(yǎng)皿中，待其貼壁生長至融合度接近80%時進行Ⅷ因子相關抗原鑒定。用PBS溶液輕緩漂洗細胞5 min×3次，濾紙吸干殘存液；滴加預冷的4%多聚甲醛，覆蓋于細胞表面，常溫固定15min；甩棄固定液，PBS溶液輕緩漂洗5min×3次，滴加0.3%Triton X-100，透膜15min；傾倒透膜液，PBS溶液漂洗5min×3次，滴加5%牛血清白蛋白，室溫封閉20min；甩棄封閉液，滴加1:300稀釋的兔抗大鼠VIII因子相關抗原抗體覆蓋于待測細胞表面，置于濕盒中，4℃孵育過夜；復溫，甩棄一抗，PBS溶液漂洗5min×3次，滴加羊抗兔IgG抗體，37℃孵育30min；甩棄二抗，PBS溶液漂洗5min×3次，滴加SABC，37℃孵育30min；PBS漂洗5min×3次，DAB室溫顯色，倒置相差顯微鏡下控制染色時間，并拍照成像。

結 果

1 原代大鼠RVECs生長情況

倒置相差顯微鏡下觀察可見：接種于培養(yǎng)皿中的血管組織碎片培養(yǎng)48h后開始貼壁，細胞以組織塊為中心，向外遷移，島嶼狀細胞團初步形成（圖AC）。96h后細胞集落逐漸融合，鋪滿皿底，呈典型的單層、扁平、鋪路石樣鑲嵌式排列（圖D、E）。少數鋪路石樣細胞則被神經細胞纏繞包圍，成混雜式生長（圖F）。

圖1 原代大鼠RVECs在不同時間點的生長狀態(tài)與形態(tài) A—C：接種48h后微血管內皮細胞以貼壁的血管組織碎塊為中心，開始向外周遷移，島嶼狀細胞團初步形成； D和E：96 h后細胞鋪滿皿底，呈典型的單層、扁平、鋪路石樣鑲嵌式排列； F：少數鋪路石樣細胞被神經膠質細胞纏繞包圍，呈混雜式生長。比例尺：A—D和F，100μm；E，50μmFig. 1 The growth state and morphological observation of RVECs at different time points. A to C：the microvascular endothelial cells began to migrate outward with adherent vascular tissue fragments as center and the island shaped cell masses initially formed after 48h of inoculation； D and E: the cells were spread all over the bottom of the culture dish, forming a typical single-layer, flat, paving stone like mosaic arrangement after 96h of inoculation;F: a small number of paving stone-like cells are entwined and surrounded by glial cells and grow in a promiscuous manner. Scale bar: A to D, and F,100μm; E, 50μm

2 傳代大鼠RVECs生長情況

細胞消化傳代接種24h后，可見到短梭形或多角形的內皮細胞貼壁、伸展，呈團簇狀分布（圖A）；5～6d后細胞群落相互融合，均勻鋪滿皿底，細胞形態(tài)保持不變，仍然呈典型的單層、扁平、鋪路石樣鑲嵌式排列生長（圖B、C）。

3 第Ⅷ細胞因子相關抗原免疫細胞化學表達

第一代RVECs傳代細胞Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色顯示，細胞結構層次分明，胞質、胞核淡染成棕紅色（圖A、C）；蘇木素襯染后，胞核淡染成淺藍色（圖B）。

討 論

原代大鼠RVECs培養(yǎng)方法，主要包括組織塊法和化學酶消化法。前者操作相對簡單，但培養(yǎng)周期較長，不能完全保證每次原代細胞都能從組織塊中爬出，且雜細胞較多，后期目的細胞的純化工作也相對麻煩，實驗成功率較低，目前國內僅有莊淼等[8]少數學者報道和使用過該方法。

圖2 傳代后大鼠RVECs融合前后的形態(tài)特點。A：傳代24h后短梭形或多角形的微血管內皮細胞貼壁、伸展，呈團簇狀分布；B和C：3～4d后細胞集落逐漸融合，細胞形態(tài)仍然保持典型的單層、扁平、鋪路石樣鑲嵌式排列生長。比例尺：A和B，100μm；C，50μmFig. 2 Morphological observation of cells before and after fusion after cell passage. A：the microvascular endothelial cells in short spindle shape or polygon shape were adherent and extended, and distributed in clusters after passage for 24h; B and C: the cell colonies gradually fused and the cell morphology still maintained the typical monolayer, flat, paving stone like mosaic arrangement after passage for 3 to 4d. Scale bar: A and B, 100μm; C,50μm

圖3 第一代大鼠RVECs VIII因子免疫細胞化學染色。A和C：100倍、400倍鏡下細胞結構分明，胞質、胞核呈現棕紅色，VIII因子免疫細胞化學染色表達為陽性；B：蘇木素襯染，細胞核淡染成淺藍色。比例尺：A，200μm；B，100μm；C，50μmFig. 3 Iμmunocytochemistry staining of factor VIII related antigen in rat RVECs of the first passage. A and C: the cell structure is clear under the ×100 and ×400 magnification views, the cytoplasm and nuclei show brownish red, means positive expression of factor VIII related antigen；B: the nucleus is lightly blue stained after hematoxylin counter staining. Scale bar: A, 200μm; B, 100μm; C, 50μm

化學酶消化法則是通過酶的消化作用，松解視網膜微血管的周細胞，使內皮細胞更容易從血管碎塊中爬出，生長速度亦高于單純的組織塊培養(yǎng)法，因而成功率較高并最為常用，其中消化酶的種類、濃度以及作用時間是實驗的關鍵。如國內學者王征等[9]采用由膠原酶、DNA酶和蛋白酶E組成的混合酶進行消化；而楊密清等[10]則選擇單一的0.2%Ⅰ型膠原酶，持續(xù)消化25mim，其優(yōu)點在于酶液對細胞的化學損傷較小，存活率較高；毛羽翔[11]、李斌等[12]則采用二步酶消化法，依次用2%的胰蛋白酶和0.133%的膠原酶消化血管組織15min，縮短了消化時間。本研究經過反復實踐探索，發(fā)現消化酶使用時，提前37℃預熱30min，可達到酶液的最佳活性；同時，0.1%II型膠原酶消化15～20min，可松動周細胞，使周細胞在外力吹打作用下更容易脫落，培養(yǎng)出的微血管內皮細胞純度更高。

此外，原代大鼠RVECs培養(yǎng)過程中最常見的問題是雜細胞的污染。為了減少大血管內皮細胞、視網膜色素上皮細胞、周細胞等雜細胞的混入，保證培養(yǎng)的目的細胞大部分為大鼠RVECs，如何分離視網膜組織以獲得純度較高的內皮細胞是實驗能否成功的關鍵。目前大鼠RVECs的純化方法較多，但各有利弊，如魯建明等[13]在培養(yǎng)的血管內皮細胞純度達到90%后，采用單細胞克隆法進一步純化細胞，但該方法操作難度較高，實驗周期長，不便于推廣。田景毅[14]、林勇等[15]則采用磁珠篩選法進行純化，但磁珠價格昂貴，且一般實驗室不具備操作所必需的磁化儀器。徐國興等[16]則根據細胞比重的不同，采用percoll細胞分離液進行純化，通過高速離心，使不同比重的細胞分層而將內皮細胞與周細胞分離，其大鼠RVECs純度可達98%，但該方法需要使用高速離心機，且操作也相對繁瑣，所以推廣亦有一定難度。丁煜等[17]則根據細胞對基質粘附性的不同，采用差速消化方法，使用胰酶將粘附性較低的內皮細胞先消化脫壁下來，吹洗收集細胞后，通過不斷傳代進行細胞純化。課題組則認為：視網膜的細胞組分復雜，大鼠RVECs的純化工作是一個將多種細胞純化方法結合、聯合使用的過程，主要包括：①反復漂洗以去除視網膜色素上皮細胞；②通過3次不同孔徑的細胞篩網以去除Müller神經膠質細胞和周細胞；③根據細胞之間貼壁、粘附能力的不同，使用差速消化法去除成纖維細胞；④反復多次換液及傳代去除紅細胞、神經元等；⑤利用大鼠RVECs的細胞群體優(yōu)勢和生長優(yōu)勢約束和抑制其它雜細胞的生長。通過以上方法，結合實驗室自身條件，采用綜合手段即可達到純化大鼠RVECs的目的。

總之，本實驗將酶化學消化法與物理過篩法結合，成功培養(yǎng)出了純度較高的大鼠RVECs，并針對該細胞特異性VIII因子相關抗原，運用免疫細胞化學染色方法，結合細胞形態(tài)學觀察，對所培養(yǎng)的目的細胞進行了鑒定。該方法簡便高效，實驗成本低，成功率高，值得推廣。