阿帕替尼調(diào)控SOX5/GLUT4信號軸對胃癌細(xì)胞糖酵解的影響

吳現(xiàn)磊 ，宋錦添 2，侯鵬飛 ，秦二云 ，孟妍 ，張令巧

（1.濮陽市油田總醫(yī)院消化內(nèi)科，河南濮陽 457001；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/福建省腫瘤醫(yī)院消化道腫瘤內(nèi)科，福建 福州 350014）

胃癌是最常見的癌癥類型之一，在癌癥相關(guān)的死亡人數(shù)中排名第2[1]。早期胃癌可通過手術(shù)切除進(jìn)行治療，但大部分患者確診時已為晚期，靶向藥物治療是常用的治療方法，對癌癥基礎(chǔ)的復(fù)雜病理生理學(xué)的深入了解和對癌癥相關(guān)的分子生物標(biāo)志物的識別，推動了靶向抗腫瘤藥物的開發(fā)[2]。

腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程的一個關(guān)鍵特征是異常的血管生成，因此，抑制腫瘤血管生成或破壞現(xiàn)有腫瘤血管系統(tǒng)的藥物受到廣泛關(guān)注[3]。血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）是參與血管生成的兩種酪氨酸激酶受體之一，當(dāng)被其配體VEGF激活時能促進(jìn)血管形成、腫瘤增殖和遷移[4]。阿帕替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），它能高度選擇性地結(jié)合并強(qiáng)烈抑制VEGFR-2從而達(dá)到抑制血管生成的作用[5]。一項(xiàng)Ⅱ期研究顯示，與安慰劑相比，阿帕替尼改善了化療難治性晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者的OS和PFS[6]。隨機(jī)、安慰劑對照的Ⅲ期試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)阿帕替尼對至少有2種既往全身化療失敗的晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌的患者有療效[7]。但阿帕替尼在胃癌中的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)研究還不夠充分，有待進(jìn)一步研究完善。

SRY相關(guān)高遷移率族盒蛋白-5（SOX5）是SOX家族蛋白的一員，并作為轉(zhuǎn)錄因子參與胚胎的發(fā)育[8-9]。SOX5在各種類型的癌癥中起重要作用。據(jù)報道SOX5可能通過與yes相關(guān)蛋白1（YAP1）相互作用而成為致癌因子，從而促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和增殖[10]。此外，已發(fā)現(xiàn)SOX5可以促進(jìn)2型糖尿病患者的葡萄糖代謝[11]。而GLUT4是與糖酵解相關(guān)的基因[12]。目前，已有研究表明阿帕替尼能通過抑制胃癌細(xì)胞的糖酵解調(diào)控胃癌的增殖和凋亡。但相關(guān)通路研究較少，且沒有關(guān)于SOX5/GLUT4信號軸在阿帕替尼抑制胃癌糖酵解中的研究。

本研究探討了阿帕替尼對胃癌細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸影響葡萄糖代謝抑制胃癌細(xì)胞活力。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

細(xì)胞代謝分析儀（美國安捷倫科技有限公司，型號Seahorse XFp）；酶標(biāo)儀（美國BioTek有限公司，型號ELx800）；qRT-PCR熒光定量儀（美國Applied Biosystems公司，型號7900HT）；乳酸比色測定試劑盒、葡萄糖攝取比色測定試劑盒（北京安諾倫有限公司）；CCK-8（日本Dojindo）；BCA定量試劑盒、Lipofectamine 2000（賽默飛世爾科技公司）；阿帕替尼（美國MedChemExpress公司，批號YN968D1）。

1.2 細(xì)胞系來源及培養(yǎng)

本研究中使用的細(xì)胞系為胃癌細(xì)胞系BGC-823（BNCC337689），購自北納生物（中國北京）。BGC-823在含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。置于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。阿帕替尼購自MCE（MedChemExpress）。稱取50 mg阿帕替尼溶于1 mL DMSO后放入?20℃冰箱保存，使用時用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組

重組質(zhì)粒pENTER-SOX5（oe-NC）和SOX5的過表達(dá)質(zhì)粒（oe-SOX5）、GLUT4的過表達(dá)質(zhì)粒（oe-GLUT4）均購自Vigene Biosciences（中國濟(jì)南）。根據(jù)生產(chǎn)商的說明通過Lipofectamine 2000（Invitro‐gen，Carlsbad，CA，USA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。并根據(jù)本課題實(shí)驗(yàn)要求，分為：control組、不同濃度（0μmoL/L、10μmoL/L、20μmoL/L、30μmoL/L、40μmoL/L、50μmoL/L）阿帕替尼處理組（oe-NC+apatinib）、過表達(dá)SOX5并阿帕替尼處理組（oe-SOX5+apa‐tinib）、過表達(dá)GLUT4并阿帕替尼處理組（oe-GLUT4+apatinib）。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用Trizol（Invitrogen）按照制造商的方案從胃癌細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒（Invitrogen）合成cDNA。qRT-PCR在ABI 7900HT儀器上進(jìn)行。使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）進(jìn)行定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參分別歸一化處理。所用引物見表1。結(jié)果用2?ΔΔCt值來比較對照組和實(shí)驗(yàn)組的目的基因相對表達(dá)量的差異。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞使用冷PBS洗滌3次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，然后加入10μL上樣緩沖液95℃煮10 min后，于100 V進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉液（5%BSA/TBST）封閉60 min。加入一抗兔抗GLUT4（abcam，USA）、SOX5（abcam，USA）、β-actin（abcam，USA），4℃過夜孵育。一抗孵育完畢后，用1×TBST溶液（Solarbio，Beijing，China）室溫下?lián)u床搖動洗膜，5 min×3次，加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG（abcam，USA），室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次，每次20 min后用ECL試劑盒（Solarbio，Beijing，China）進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，拍照觀察蛋白印記。

1.6 細(xì)胞增殖能力測定

CCK8法測試細(xì)胞增殖能力。將5×103個胃癌細(xì)胞接種到具有100μL培養(yǎng)基的96孔板中的每孔中。設(shè)置空白孔（有培養(yǎng)基，無細(xì)胞）和對照孔（培養(yǎng)基不加藥，有細(xì)胞）。第2天，用不同濃度的阿帕替尼處理細(xì)胞。使用CCK-8溶液繼續(xù)孵育1 h。監(jiān)測48 h后的細(xì)胞存活率，并通過2次吸收后的吸光度測量評估存活細(xì)胞的數(shù)量。使用酶標(biāo)儀測定450 nm各孔的吸光值。將各測試孔的吸光度A減去調(diào)零孔吸光度A或?qū)φ湛孜舛華。各重復(fù)孔的吸光度A取平均數(shù)。細(xì)胞生存率=（加藥細(xì)胞吸光度A?空白吸光度A）/（對照細(xì)胞吸光度A?空白吸光度A）×100%。

1.7 糖酵解過程分析（葡萄糖攝取、乳酸生成、細(xì)胞外酸化速率）

將細(xì)胞預(yù)處理24 h，接種在96孔板中并保持過夜。去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS洗滌3次，然后根據(jù)制造商的規(guī)程，使用葡萄糖攝取比色測定試劑盒測定葡萄糖攝取。為了測量乳酸，將細(xì)胞在不含酚紅的DMEM中（Hyclone，USA）培養(yǎng)15 h，然后收集培養(yǎng)基。使用乳酸比色測定試劑盒對乳酸水平進(jìn)行定量，并使用BCA蛋白測定試劑盒針對相應(yīng)的總蛋白質(zhì)水平對濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了測量細(xì)胞外酸化速率，將糖酵解壓力試劑盒中的藥物誘導(dǎo)劑分別加入加藥板上的各加藥孔中，其中葡萄糖、寡霉素及2-脫氧葡萄糖的使用濃度分別為10 mmol/L、1μmol/L及50 mmol/L。隨后采用細(xì)胞代謝分析儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率，并計(jì)算糖酵解能力值及糖酵解保留值。

1.8 GLUT4啟動子活性檢測

將長度約500 bp的GLUT4基因啟動子區(qū)作為pGL3-GLUT4-Promoter插入到pGL3堿性熒光素酶報告載體中。根據(jù)制造商的說明，使用QuikChange定點(diǎn)誘變試劑盒（Stratagene）對GLUT4啟動子進(jìn)行定點(diǎn)誘變，通過DNA測序確認(rèn)突變。將100 ng構(gòu)建的質(zhì)粒和7 ng Renilla熒光素酶對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到6孔板中SOX5過表達(dá)或沉默的細(xì)胞中。48 h后，使用雙熒光素酶測定試劑盒（Promega，USA）測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性。利用海腎熒光素將報告熒光素酶活性結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿帕替尼對胃癌細(xì)胞的增殖和糖酵解的影響

檢測結(jié)果顯示，阿帕替尼可濃度依賴性地抑制BGC-823細(xì)胞的體外增殖（圖1A）。20μmol/L阿帕替尼處理后可顯著降低BGC-823細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取量（圖1B）和乳酸生成量（圖1C）。為進(jìn)一步證實(shí)阿帕替尼對胃癌細(xì)胞有氧糖酵解活性的抑制作用，細(xì)胞代謝分析儀檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，用阿帕替尼處理后，癌細(xì)胞外酸化速率降低。表明阿帕替尼可抑制由寡霉素（oligomycin）激活的BGC-823細(xì)胞的有氧糖酵解活性（圖1D）。進(jìn)一步對各糖酵解參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)相較于對照組，阿帕替尼處理組的BGC-823細(xì)胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值均明顯下降（圖1E）。這些結(jié)果表明阿帕替尼能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和糖酵解。

圖1 阿帕替尼對胃癌細(xì)胞的增殖和糖酵解的影響Figure 1 Effect of apatinib on the proliferation and glycolysis of gastric cancer cells

2.2 阿帕替尼通過SOX5對胃癌細(xì)胞中的GLUT4啟動子活性的影響

結(jié)果顯示SOX5和GLUT4的表達(dá)量均隨著阿帕替尼濃度的升高而下降（圖2A～圖2B）。20μmol/L阿帕替尼處理后，SOX5和GLUT4的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)；阿帕替尼處理的同時過表達(dá)SOX5，SOX5和GLUT4的蛋白表達(dá)量相比于僅用阿帕替尼處理顯著上調(diào)（圖2C）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測各處理組GLUT4啟動子活性，發(fā)現(xiàn)用阿帕替尼處理后GLUT4啟動子活性顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理細(xì)胞并過表達(dá)SOX5后，GLUT4啟動子活性明顯高于僅用阿帕替尼處理（圖2D）。這些結(jié)果表明阿帕替尼能通過SOX5調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中的GLUT4啟動子活性。

圖2 阿帕替尼通過SOX5對胃癌細(xì)胞中的GLUT4啟動子活性的影響Figure 2 Effect of apatinib on the activity of GLUT4 promoter in gastric cancer cells through SOX5

2.3 阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和糖酵解的影響

qRT-PCR檢測各處理組SOX5和GLUT4的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示阿帕替尼處理后SOX5和GLUT4的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)SOX5后,SOX5和GLUT4的mRNA表達(dá)水平相較于僅用阿帕替尼處理均發(fā)生顯著上調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)GLUT4后SOX5 mRNA表達(dá)水平相較于僅用阿帕替尼處理沒有顯著變化，GLUT4 mRNA表達(dá)水平則發(fā)生顯著上調(diào)（圖3A）。CCK8檢測各處理組細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示阿帕替尼處理后細(xì)胞生存率顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)SOX5或GLUT4后，細(xì)胞生存率相較于僅用阿帕替尼處理均發(fā)生顯著上調(diào)（圖3B）。比色法結(jié)果顯示，阿帕替尼處理后葡萄糖攝取和乳酸生成速率均顯著下調(diào)；用阿帕替尼處理并同時過表達(dá)SOX5或GLUT4后則發(fā)生顯著上調(diào)（圖3C～圖3D）。細(xì)胞代謝分析儀檢測結(jié)果顯示過表達(dá)SOX5或GLUT4能逆轉(zhuǎn)阿帕替尼對細(xì)胞外酸化速率的抑制作用（圖3E）。進(jìn)一步對各糖酵解參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，過表達(dá)SOX5或GLUT4能逆轉(zhuǎn)阿帕替尼對細(xì)胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值的抑制作用（圖3F）。阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸抑制胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和糖酵解。

圖3 阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和糖酵解的影響Figure 3 Effect of apatinib on the cell viability and glycolysis of gastric cancer cells through the SOX5/GLUT4 axis

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，估計(jì)每年全球有超過100萬的新病例，同時由于胃癌的診斷往往處于晚期，其死亡率很高[1]。糖酵解是癌癥的一個新特征，糖酵解產(chǎn)生能量和營養(yǎng)，并產(chǎn)生乳酸，為癌細(xì)胞生長提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境[13]。因此，靶向糖酵解是一種新的治療策略。本研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸調(diào)控胃癌細(xì)胞糖酵解并有效抑制細(xì)胞活力。

阿帕替尼在晚期胃癌中被證實(shí)是一種安全有效的小分子抗血管生成靶向藥物，也是晚期胃癌標(biāo)準(zhǔn)化療失敗后，明顯延長生存期的單藥[14]。已有大量報道闡釋關(guān)于阿帕替尼對多種癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。例如Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過調(diào)節(jié)凋亡和自噬來調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長；阿帕替尼通過下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α和增加活性氧自由基水平促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡[16]；阿帕替尼通過AKTmTOR途徑誘導(dǎo)間變性甲狀腺癌保護(hù)性自噬和凋亡[17]。因此，推測阿帕替尼可能通過抑制特定的細(xì)胞功能，包括糖酵解來抑制胃癌細(xì)胞的活力。本研究使用不同濃度的阿帕替尼對胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼處理后癌細(xì)胞的糖酵解能力和細(xì)胞活力下降。

SOX5是SOX家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，在多種癌癥類型的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道，SOX5通過激活twist介導(dǎo)的胃癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[18]；SOX5通過轉(zhuǎn)激活EZH2促進(jìn)乳腺癌的增殖和侵襲[19]；SOX5通過STAT3信號通路誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)肺腺癌血管生成[20]。這表明SOX5在胃癌可能作為一種癌基因發(fā)揮作用。此外有文獻(xiàn)報道在卵巢癌細(xì)胞中，阿帕替尼能夠抑制SOX5，進(jìn)而抑制GLUT4的轉(zhuǎn)錄活性[21]。并且GLUT4已被證明與糖酵解有關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道趨勢一致，表明在胃癌細(xì)胞中阿帕替尼能夠降低SOX5的表達(dá)，從而抑制GLUT4的啟動子活性，來發(fā)揮其抑制糖酵解作用。

本研究結(jié)果表明，阿帕替尼可能通過抑制SOX5/GLUT4信號軸，抑制胃癌細(xì)胞糖酵解和細(xì)胞活力，為阿帕替尼調(diào)控糖酵解的機(jī)制提供了新的見解。