劉 娜，宋 瑩，呂立濤，張 敏

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

羊肚菌（Morchellaspp.），隸屬子囊菌門(mén)（Ascomycota） 盤(pán)菌亞門(mén)（Pezizomycotina） 盤(pán)菌綱（Pezizomycetes） 盤(pán)菌亞綱 （Pezizomycetidae） 盤(pán)菌目（Pezizales） 羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌屬[MorchellaDill.ex Pers.,Neues Mag.Bot.1:116(1794)][1]。因其濃郁而不膩的風(fēng)味、清爽脆嫩的口感、豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和顯著的保健功效被世人所喜愛(ài)。梯棱羊肚菌（Morchella importuna）是羊肚菌屬下黑色羊肚菌類群，是近年來(lái)我國(guó)馴化、推廣栽培的菌種[2]，在東北已經(jīng)形成日光溫室小規(guī)?；耘嗄Ｊ?。然而，由于在該生產(chǎn)過(guò)程中仍存在很多亟待解決的問(wèn)題，使得梯棱羊肚菌產(chǎn)量不穩(wěn)定，故對(duì)其菌絲體培養(yǎng)特性的報(bào)道較少。羊肚菌菌絲體的生長(zhǎng)、菌核的形成除需適宜的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)外，還必須在特定的外界條件下，才能使其從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)，形成子實(shí)體原基，進(jìn)而發(fā)育成正常的子實(shí)體。這些外界條件包括溫度、pH、碳源、氮源等，不同品種的羊肚菌菌絲在不同條件下，生長(zhǎng)狀態(tài)有所不同，生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)、色澤等菌落形態(tài)特征存在差別。同時(shí)，作為子實(shí)體培育先決條件的菌核，其形成時(shí)間、數(shù)量和分布方式也受到明顯影響。因此，探索不同菌株菌絲的最佳培養(yǎng)溫度、pH、碳源、氮源非常必要[3]。2017年7月，在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所試驗(yàn)室，通過(guò)對(duì)5株梯棱羊肚菌菌絲在不同溫度、pH和碳源、氮源條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究，分別篩選出培養(yǎng)5株梯棱羊肚菌菌絲體最適培養(yǎng)溫度、pH、碳源、氮源，為其菌種生產(chǎn)及規(guī)?；耘嗵峁├碚撘罁?jù)和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供，詳情見(jiàn)表1。

表1 供試菌株Tab.1 Tested strains of Morchella importuna

1.1.2 培養(yǎng)基配方

基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g，水 1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度試驗(yàn)

用已滅菌的打孔器（直徑6 mm）均勻截取活化好的菌絲體組織塊，接種于基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃恒溫避光培養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，觀察記錄[4]。

1.2.2 pH試驗(yàn)

采用基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基，分別用10%氫氧化鈉和10%鹽酸調(diào)節(jié)其 pH，設(shè)為 4、5、6、7、8、9、10、11、12，每處理3次重復(fù)。各培養(yǎng)基分別接種菌絲體組織塊，置于20℃恒溫避光培養(yǎng)，記錄生長(zhǎng)情況[5]。

1.2.3 碳源試驗(yàn)

以基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基中20 g葡萄糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相等含碳量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖代替基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變，對(duì)比菌絲生長(zhǎng)情況[6]。

1.2.4 氮源試驗(yàn)

以基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基中2 g蛋白胨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相等含氮量的尿素、氯化銨、硝酸銨、酵母粉代替基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他成分不變，對(duì)比菌絲生長(zhǎng)情況[6]。

1.3 數(shù)據(jù)記錄與分析

觀察并記錄菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)和長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的時(shí)間[7-9]。以菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的時(shí)間為最終培養(yǎng)時(shí)間，以接種塊為中心用刻度尺測(cè)量菌落直徑（cm），隨機(jī)測(cè)量3次，取平均值。記錄菌核形成時(shí)間，培養(yǎng)7 d后觀察菌核分布方式[10]。菌絲日均生長(zhǎng)速度（V，cm·d-1）公式為：

式中：R表示菌落直徑（cm）；D表示培養(yǎng)時(shí)間（d）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下各菌株菌絲和菌核生長(zhǎng)特性

不同溫度下各菌株菌絲生長(zhǎng)速度見(jiàn)表2。

由表2可知，在PDA培養(yǎng)基上，5個(gè)供試菌株在溫度5℃～30℃范圍均能生長(zhǎng)。菌絲生長(zhǎng)速度隨著溫度升高而加快，在溫度25℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，之后隨著溫度的升高，菌絲生長(zhǎng)速度變慢。不同溫度梯度各菌株菌核特征見(jiàn)表3。

表2 不同溫度下5株羊肚菌菌絲生長(zhǎng)速度Tab.2 Mycelial growth rate of 5 Morchella importuna at different temperature

表3 不同溫度下各菌株菌核特征Tab.3 Sclerotium growth characteristics of Morchella importuna at different temperature

表3中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接種點(diǎn)為中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接種點(diǎn)周圍。由表3可知，5個(gè)菌株在不同溫度下，菌核形成時(shí)間及菌核生長(zhǎng)情況不同。溫度的高低對(duì)菌核的形成有影響，在溫度5℃條件下，5個(gè)菌株培養(yǎng)7 d均不能形成菌核；在溫度10℃和15℃條件下，菌株003、菌株004和菌株005培養(yǎng)7 d均不能形成菌核；在溫度20℃和25℃條件下，5個(gè)菌株都能形成菌核；在溫度30℃條件下，除了菌株003外，其他菌株都能形成菌核。從菌核形成時(shí)間來(lái)看，溫度越低菌株001和菌株002菌核形成越慢，溫度越高菌核形成越快；其他3個(gè)菌株除了菌株004在溫度20℃下96 h（4 d） 可形成菌核外，其他菌株都是120 d（5 d） 形成菌核。從菌核分布來(lái)看，菌株001和菌株002在溫度10℃～30℃條件下，除了菌株002在溫度10℃條件下菌核分布為分散型外，這兩個(gè)菌株在其他條件下菌核分布都為聚集型；菌株003、菌株004和菌株005的菌核分布都為分散型。從菌核密度來(lái)看，菌株001在溫度10℃和30℃下，菌核密度小于在其他3個(gè)溫度下的菌核密度；菌株002在溫度15℃和30℃下菌核密度小于在其他3個(gè)溫度下的菌核密度。從菌核顏色來(lái)看，菌株001和菌株002的菌核顏色隨著溫度升高，顏色逐漸加深；其他3個(gè)菌株都為乳白色。

2.2 不同pH處理各菌株菌絲及菌核生長(zhǎng)特性

不同pH處理各菌株生長(zhǎng)速度見(jiàn)表4。

表4 不同pH處理各菌株生長(zhǎng)速度Tab.4 Mycelial growth rate of Morchella importuna at different pH value

由表4可知，在PDA培養(yǎng)基上，5個(gè)供試菌株在pH為4～12范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，在不同pH下生長(zhǎng)速度差異明顯。菌株001、菌株004和菌株005在pH為4～7范圍內(nèi)，隨著pH的升高菌絲生長(zhǎng)速度逐漸加快；在pH為8～12范圍內(nèi)，隨著pH的升高菌絲生長(zhǎng)速度逐漸減慢。菌株002和菌株003在pH為4～8范圍內(nèi)，隨著pH的升高菌絲生長(zhǎng)速度逐漸加快；在pH為9～12范圍內(nèi)，隨著pH的升高菌絲生長(zhǎng)速度逐漸減慢。不同pH處理各菌株菌核特征見(jiàn)表5。

表5 不同pH下各菌株菌核特征Tab.5 Sclerotium characteristics of Morchella importuna at different pH

（續(xù)表 5）

表5中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接種點(diǎn)為中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接種點(diǎn)周圍。由表5可知，在pH為12時(shí)，5個(gè)菌株均不能形成菌核。從菌核形成時(shí)間看，pH為4時(shí)，5個(gè)菌株菌核形成需要120 h（5 d）；在pH為6～10時(shí)，5個(gè)菌株菌核形成需要96 h（4 d）。 從菌核分布看，菌株001和菌株002在pH為4～7時(shí)菌核分布為分散型，在pH為4～7時(shí)菌核分布為聚集型；菌株003、菌株004和菌株005在pH為4～11時(shí)菌核分布為分散型。從菌核密度看，5個(gè)菌株在pH為4、10、11時(shí)，菌核密度相對(duì)較小，其他pH條件下菌核密度各有差異，密度不同。從菌核顏色看，菌株001和菌株002在pH為4～7時(shí)菌核顏色淺黃，在pH為8～11時(shí)菌核顏色黃色，說(shuō)明隨著pH升高，這兩個(gè)菌株菌核顏色逐漸變深；菌株003在pH為4～11時(shí)菌核顏色淺黃；菌株004在pH為4～8時(shí)菌核顏色乳白色，pH為9時(shí)菌核淺黃色，pH為10～11時(shí)菌核黃色，說(shuō)明隨著pH升高，菌株菌核顏色逐漸變深；菌株005在pH為8時(shí)菌核顏色乳白色，pH為4～7和9時(shí)菌核淺黃色，pH為10和11時(shí)菌核黃色，說(shuō)明此菌株受pH影響，菌核顏色變化差異大。不同碳源條件下各菌株生長(zhǎng)速度見(jiàn)表6。

表6 不同碳源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.6 Effect of different carbon source on mycelial growth rate of Morchella importuna

由表6可知，菌株001在不同碳源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：葡萄糖＞乳糖＞麥芽糖＞淀粉＞蔗糖；菌株002在不同碳源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：乳糖＞淀粉＞蔗糖＞葡萄糖，麥芽糖；菌株003在不同碳源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：乳糖＞葡萄糖＞淀粉＞麥芽糖＞蔗糖；菌株004在不同碳源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞淀粉，麥芽糖；菌株005在不同碳源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：葡萄糖＞麥芽糖＞蔗糖＞淀粉＞乳糖。不同碳源條件下各菌株菌核特征見(jiàn)表7。

表7 不同碳源羊肚菌菌核形成情況Tab.7 Effect of different carbon source on sclerotium characteristica of Morchella importuna

表7中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接種點(diǎn)為中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接種點(diǎn)周圍。由表7可知，菌株001和菌株003在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d不能形成菌核；菌株002在以淀粉和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d不能形成菌核；菌株004在淀粉和乳糖培養(yǎng)基中不能形成菌核；菌株005在5種碳源培養(yǎng)基中均能形成菌核。從菌核形成時(shí)間來(lái)看，5個(gè)菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，形成菌核時(shí)間一樣都是96 h（4 d），在其他可形成菌核的培養(yǎng)基里菌核形成的時(shí)間不同。從菌核分布來(lái)看，菌株001、菌株002和菌株005的菌核分布為分散型；菌株003和菌株004在5種碳源里，除了菌株003在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中是分散型，在其他可形成菌核的碳源培養(yǎng)基里都是聚集型。從菌核密度來(lái)看，菌株001和菌株002在5種碳源里形成菌核較少，對(duì)其他3個(gè)菌株的菌核多少影響更明顯。從菌核顏色上來(lái)看，5個(gè)菌株在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中菌核顏色為乳白色，在其他形成菌核的碳源里顏色深淺不同。不同氮源條件下各菌株生長(zhǎng)速度見(jiàn)表8。

表8 不同氮源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.8 Effect of different nitrogen source on mycelial growth rate of Morchella importuna

由表8可知，5個(gè)梯陵羊肚菌菌株在5種不同氮源上均能生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度差異明顯。菌株001在不同氮源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：蛋白胨＞氯化胺＞硝酸銨＞酵母膏＞尿素；菌株002在不同氮源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：酵母膏＞蛋白胨＞氯化胺＞硝酸銨＞尿素；菌株003在不同氮源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：蛋白胨＞硝酸銨＞酵母膏＞氯化胺＞尿素；菌株004在不同氮源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：硝酸銨＞蛋白胨＞氯化胺，酵母膏＞尿素；菌株005在不同氮源下菌絲生長(zhǎng)速度大小為：硝酸銨＞氯化胺，酵母膏＞蛋白胨＞尿素。5個(gè)梯棱菌株不同氮源下菌核特征見(jiàn)表9。

表9 不同氮源對(duì)梯棱羊肚菌菌核形成的影響Tab.9 Effect of different nitrogen source on sclerotium characteristics of Morchella importuna

表9中，菌核分布方面，分散表示菌核分布在以接種點(diǎn)為中心，向四周分散；聚集表示菌核全部聚集在接種點(diǎn)周圍。由表9可知，在硝酸銨、氯化胺和尿素為氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d均不能形成菌核。從菌核形成時(shí)間上來(lái)看，5個(gè)菌株在蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中菌核的形成時(shí)間不同。從菌核分布上來(lái)看，菌株001和菌株002在蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中菌核分布為聚集型，菌株003、菌株004和菌株005的菌核分布各有不同。從菌核密度上來(lái)看，5個(gè)菌株在形成菌核的氮源里多數(shù)菌核數(shù)量較多，只有菌株003在酵母膏培養(yǎng)基中菌核數(shù)量較少，菌株005在蛋白胨培養(yǎng)基中菌核數(shù)量較少；從菌核顏色上來(lái)看，5個(gè)菌株菌核都為黃色。

3 結(jié)論

溫度在5℃～30℃范圍內(nèi)，5株梯棱羊肚菌菌絲均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度差異明顯。從菌絲生長(zhǎng)速度和菌核形態(tài)方面綜合比較：菌株F011菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為20℃～25℃、pH為6～7、碳源為葡萄糖和麥芽糖，氮源為蛋白胨和酵母膏；菌株Q菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為20℃～25℃、pH為8～9、碳源為葡萄糖和蔗糖，氮源為蛋白胨和酵母膏；菌株301菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為20℃～25℃、pH為7～8、碳源為葡萄糖和淀粉，氮源為蛋白胨和酵母膏；菌株85菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為20℃～25℃、pH為6～7、碳源為葡萄糖和蔗糖，氮源為酵母膏；菌株W16H2菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為20℃～25℃、pH為6～7、碳源為葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，氮源為蛋白胨和酵母膏。

在相同條件下，不同羊肚菌菌株所形成的菌核，在顏色、數(shù)量方面存在很大的遺傳差異性[11]；菌株不同，其菌核的形成特征也不同[12]。而試驗(yàn)中，存在一些比較極端的條件，導(dǎo)致5個(gè)菌株中只有少數(shù)菌株才能產(chǎn)生菌核，或5個(gè)菌株均不產(chǎn)生菌核的情況。在溫度為5℃的條件下，可能由于菌絲未長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，所以并未形成菌核；當(dāng)pH為12時(shí)不產(chǎn)生菌核；乳糖和淀粉影響菌核形成；在5種氮源中，只有蛋白胨和酵母膏培養(yǎng)基中菌株形成菌核，其他3種氮源對(duì)菌核形成影響較大。上述分析僅從現(xiàn)象上進(jìn)行了描述，關(guān)于其產(chǎn)生機(jī)理還需繼續(xù)研究。