花生殼中提取木犀草素及其含量測(cè)定

王智儀，郭佳佳，曹智威，馮亞莉

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南鄭州 451100）

木犀草素（3',4',5,7-四羥基黃酮）是一種天然的抗氧化劑，具有多種生物活性，如抗癌、抗菌、抗炎、心血管保護(hù)、改善和治療阿爾茨海默癥等[1-3]，具有廣泛的醫(yī)藥價(jià)值和應(yīng)用前景?；ㄉ鷼な悄鞠菟氐睦硐雭碓粗唬覈?guó)是花生生產(chǎn)、消費(fèi)和出口貿(mào)易最大的國(guó)家，花生加工業(yè)每年產(chǎn)出大量的花生殼，僅有少量用作飼料或化工原料，既嚴(yán)重污染環(huán)境，又造成浪費(fèi)。因此，開發(fā)利用花生殼中的天然黃酮類化合物木犀草素，對(duì)于有效延長(zhǎng)花生產(chǎn)業(yè)鏈、提高花生資源綜合利用效益具有重要的社會(huì)意義。如圖1 所示，為木犀草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1 木犀草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

傳統(tǒng)的水浴回流法、有機(jī)溶劑提取法及堿水提取法等存在得率較低的問題，微波輔助法和超聲波輔助法能耗和成本較高，酶輔助提取法及離子液提取技術(shù)操作繁瑣，不適于工業(yè)生產(chǎn)。本文采用連續(xù)萃取法提取花生殼中的木犀草素，考察不同萃取劑、萃取劑用量、萃取溫度及萃取時(shí)間等因素對(duì)木犀草素提取率的影響，采用高效液相法對(duì)最佳提取條件下的花生殼中木犀草素的提取率及產(chǎn)品純度進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

花生殼購(gòu)于河南省鄭州市，粉碎備用；木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（98%），上海麥克林生化科技有限公司；甲醇，色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他所用試劑均為分析純。

萃取器，鄭州市高等學(xué)校生藥學(xué)名師技術(shù)技能工作室自制；Agilent-1260 型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

稱取50 g 花生殼干粉于500 mL 燒杯中，加入200 mL 石油醚，攪拌密封后過夜，進(jìn)行脫脂處理。過濾，花生殼自然揮干后置于萃取器中，加入1 000 mL 75%乙醇，加熱回流，控制溫度為80 ℃，連續(xù)提取2 h。萃取完成后，濃縮提取液至浸膏狀，加入10 倍體積蒸餾水，靜置后取沉淀置于50 ℃恒溫干燥箱烘干，丙酮、乙酸乙酯重結(jié)晶，干燥，得木犀草素粗品。

1.3 萃取劑種類的選擇

萃取溫度為80 ℃，萃取時(shí)間為2.0 h，考察不同萃取劑對(duì)花生殼中木犀草素含量的影響。由于木犀草素分子結(jié)構(gòu)中有多個(gè)酚羥基，屬于弱酸性黃酮類化合物，為弱極性分子，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑以及稀堿溶液，因此選用75%乙醇溶液、75%甲醇溶液、75%丙酮溶液、乙酸乙酯、0.2 mol/L NaOH 溶液作為萃取劑。

1.4 萃取劑用量的選擇

固定萃取溫度為80 ℃，萃取時(shí)間為2.0 h，萃取劑為75%乙醇溶液，考察萃取劑用量對(duì)花生殼中木犀草素提取率的影響，按料液比（g/mL）為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 萃取溫度的選擇

固定料液比（g/mL）為1 ∶20，萃取時(shí)間為2.0 h，萃取劑為75%乙醇溶液，考察萃取溫度對(duì)花生殼中木犀草素提取率的影響，萃取溫度分別是40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃。

1.6 萃取時(shí)間的選擇

固定料液比（g/mL）為1 ∶20，萃取溫度為80 ℃，萃取劑為75%乙醇溶液，考察萃取時(shí)間對(duì)花生殼提取物中木犀草素提取率的影響，萃取時(shí)間分別是0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h。

1.7 HPLC 法測(cè)含量

1.7.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲混勻，得濃度為1 mg/mL 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液[4]。

供試品溶液：取木犀草素粗品1.00 mg，適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲混勻，得1 mg/mL 的供試品溶液[4]。

1.7.2 色譜條件選擇

色譜柱：ZORBAXSB-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸溶液（體積比70 ∶30），流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)(λ)：348 nm。

1.7.3 線性關(guān)系考察

取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于50 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“1.3.2”色譜條件依次進(jìn)樣分析，平行測(cè)定5 次，取平均值。以木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，進(jìn)行線性關(guān)系考察。

1.7.4 木犀草素含量測(cè)定方法

對(duì)木犀草素供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木犀草素濃度，并按照公式（1）～（2）計(jì)算木犀草素供試品純度ω和木犀草素提取率W。

式（1）中，V為供試品溶液的體積，mL；m1為稱取的木犀草素供試品質(zhì)量，mg。式（2）中，m2為提取的木犀草素產(chǎn)品總質(zhì)量，mg；m為實(shí)驗(yàn)稱取的花生殼質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=29 538X+380.98，R2=0.9974。結(jié)果表明，木犀草素在濃度為0.0625～1.000 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示：

圖2 木犀草標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同萃取劑對(duì)木犀草素提取率的影響

如表1 所示，75%乙醇溶液作為萃取劑提取的木犀草素提取率最高，75%丙酮溶液次之，因此選擇75%乙醇溶液作為萃取劑。

表1 不同萃取劑花生殼提取物中木犀草素的含量

2.3 萃取劑用量對(duì)木犀草素提取率的影響

如圖3所示，木犀草素提取率隨料液比的降低（萃取劑用量增大）而提高，在1 ∶5～1 ∶20 時(shí)，木犀草素的提取率增加較快，而當(dāng)料液比大于1 ∶20 并進(jìn)一步提高時(shí)，木犀草素提取率的增加趨勢(shì)逐漸變緩。因此，當(dāng)萃取劑是花生殼質(zhì)量的20 倍時(shí)，即料液比（g/mL）為1 ∶20 時(shí)，萃取效果較好。

2.4 萃取溫度對(duì)木犀草素提取率的影響

圖3 料液比對(duì)木犀草素提取率的影響

如圖4 所示，萃取溫度對(duì)木犀草素提取率的影響較大：當(dāng)萃取溫度低于80 ℃時(shí)，木犀草素提取率隨溫度的升高而增大，而當(dāng)萃取溫度高于80 ℃時(shí)，木犀草素提取率隨溫度的升高反而有所降低。這是由于在溶劑乙醇溶液提取溶質(zhì)木犀草素的過程中，溫度既影響溶質(zhì)在溶劑中的溶解速度，又影響溶質(zhì)向外擴(kuò)散的速度。另外，溫度的升高也會(huì)提高木犀草素在萃取劑中的溶解度。但是由于木犀草素為黃酮類化合物，對(duì)熱比較敏感，高溫會(huì)加速其氧化，所以萃取溫度并非越高越好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)萃取溫度為80 ℃左右時(shí)，萃取效果較好。

圖4 萃取溫度對(duì)木犀草素提取率的影響

2.5 萃取時(shí)間對(duì)木犀草素提取率的影響

如圖5 所示，隨著萃取時(shí)間的增加，木犀草素的提取率也增加，但是當(dāng)時(shí)間超過2.0 h 時(shí)，木犀草素的提取率呈降低趨勢(shì)。這是由于長(zhǎng)時(shí)間的加熱會(huì)造成木犀草素受熱氧化，從而使得木犀草素提取率降低，因此，選擇萃取時(shí)間為2.0 h 效果較好。

2.6 木犀草素含量測(cè)定

由1.7.4 式（1）和式（2）計(jì)算可得，花生殼中木犀草素提取率為0.32 mg/g，純度為67.86%。

3 結(jié)論

以75%乙醇溶液為萃取劑，采用連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素，料液比（g/mL）為1 ∶20，萃取溫度為80 ℃，萃取時(shí)間為2.0 h 時(shí)，提取率可達(dá)到0.32 mg/g，純度可達(dá)到67.86%。該方法節(jié)省溶劑，操作簡(jiǎn)單，工藝流程短，提取率高，含雜質(zhì)少，殘?jiān)伲哪苄?，符合綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展原則，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著，具有省工省時(shí)、便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。