HPLC法同步測(cè)定莓茶中二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素含量

張學(xué)英

（湘西自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000）

莓茶學(xué)名顯齒蛇葡萄，為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），同義名稱有藤茶、茅巖莓、神仙草等。莓茶是一種野生藤本植物，廣泛分布于我國(guó)湖南、湖北、廣西、貴州等省份，其中湖南省野生及人工種植莓茶集中在湘西土家族苗族自治州（以下簡(jiǎn)稱湘西州）和張家界市。湘西州莓茶種植歷史悠久，有“溪洲莓茶”“永順莓茶”等標(biāo)志產(chǎn)品[1-2]。顯齒蛇葡萄葉為藥食兩用物質(zhì)，其藥用成分為蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、沒(méi)食子酸、豆甾醇等[3]；具有清熱解毒、利濕消腫功效，可用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、濕熱黃疸、目赤腫痛、癰腫瘡癤[4]；2013年12月24日，原國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)將顯齒蛇葡萄葉納入可用于食品生產(chǎn)加工的新食品原料管理[5]，2019年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)將顯齒蛇葡萄葉列入最新版食藥同源目錄[6]，由此顯齒蛇葡萄葉（即莓茶葉）的食藥兩用功效被廣為人知。近年來(lái)莓茶代用茶產(chǎn)業(yè)因投入少、周期短、見(jiàn)效快、利潤(rùn)價(jià)值空間大等特點(diǎn)，己成為湘西州永順縣和鳳凰縣落實(shí)脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略而大力扶持的項(xiàng)目，莓茶被列為湘西州茶葉產(chǎn)業(yè)地方政策重大項(xiàng)目之一，廣大科研工作者對(duì)莓茶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用進(jìn)行了深入研究。例如，莓茶代用茶的研制、莓茶中藥用成分的具體功效研究等[7-17]。另外，還有很多學(xué)者對(duì)莓茶中主要活性成分如總黃酮、二氫楊梅素等檢測(cè)分析方法進(jìn)行了研究[18-22]，以及地方政府頒布了相關(guān)內(nèi)容的地方標(biāo)準(zhǔn)[23-24]。

目前，關(guān)于莓茶中特征物質(zhì)二氫楊梅素、楊梅苷及楊梅素的單獨(dú)檢測(cè)方法已有較多報(bào)道，但同時(shí)檢測(cè)3種黃酮單體的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品定性、高效液相色譜儀外標(biāo)法定量、線性關(guān)系考察及方法學(xué)評(píng)價(jià)等過(guò)程，建立一套準(zhǔn)確度高、樣品處理簡(jiǎn)便、上機(jī)檢測(cè)靈敏度高和重現(xiàn)性好的莓茶代用茶中特征物質(zhì)（二氫楊梅素、楊梅苷及楊梅素）的同步檢測(cè)方法，以期為莓茶代用茶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品來(lái)源于湖南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局，為2020年湖南省永順縣、鳳凰縣、古丈縣、張家界市、湖北省恩施州等地不同季節(jié)制成的莓茶成品以及湖南省永順縣部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)野生莓茶。試驗(yàn)前樣品需進(jìn)行簡(jiǎn)單前處理，即60℃恒溫復(fù)干1 h→粉碎→備用。3種黃酮單體標(biāo)準(zhǔn)品分別是二氫楊梅素（CAS號(hào)27200-12-0，分子式C15H12O8，純度99.5%）、楊梅苷（CAS號(hào)17912-87-7，分子式C21H20O12，純度98.5%）和楊梅素（CAS號(hào)529-44-2，分子式C15H10O8，純度99.8%），由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

主要試劑有甲醇（TEDIA牌，含量≥99.9%）、乙腈（TEDIA牌，含量≥99.9%）、磷酸（科密歐牌，含量≥85.0%）等，均為色譜純。

主要儀器有高效液相色譜儀（島津20AT，帶自動(dòng)進(jìn)樣裝置、PAD全波長(zhǎng)檢測(cè)器和可選擇波長(zhǎng)分析系統(tǒng)）、BSA-224S感量0.000 1 g分析天平、JY502感量0.01 g電子天平、KQ5200V型超聲波清洗器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取干燥恒重二氫楊梅素0.015 5 g于小燒杯中，用甲醇溶解定容至25 mL棕色容量瓶中（必要時(shí)可常溫超聲助溶），稱重冷凍貯存（常溫稱重，并用甲醇補(bǔ)至衡重），得標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為620 μg/mL，使用時(shí)用初始流動(dòng)相，將其稀釋成標(biāo)曲系列Ⅰ，二氫楊梅素濃度，依次為62、155、310、465、620 μg/mL。稱取干燥恒重楊梅苷0.007 5 g和楊梅素0.006 9 g于小燒杯中，用甲醇溶解定容至100 mL棕色容量瓶中（必要時(shí)可常溫超聲助溶），稱重冷凍貯存（常溫稱重，并用色譜純甲醇補(bǔ)至衡重），得標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ，楊梅苷和楊梅素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為75和69 μg/mL，使用時(shí)用初始流動(dòng)相，將其稀釋成標(biāo)曲系列Ⅱ，楊梅苷濃度依次為7.5、18.75、37.5、56.25、75 μg/mL，楊梅素濃度依次為6.9、17.25、34.5、51.75、69 μg/mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)曲系列Ⅰ、Ⅱ分別進(jìn)樣20 μL上機(jī)檢測(cè)，二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為290 、350和370 nm，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱C18（4.6×250 mm，5 μm）或等效柱；標(biāo)曲系列Ⅰ、Ⅱ進(jìn)樣量20 μL；樣品進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)柱溫35℃；檢測(cè)時(shí)間約41 min；流動(dòng)相A為0.1%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 檢測(cè)時(shí)間和流動(dòng)相A、B比例

1.2.4 樣品峰定性試驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)品作為待測(cè)物定性溯源的依據(jù)，在樣品處理液中依次加入微量標(biāo)準(zhǔn)品再上機(jī)檢測(cè)（加入順序?yàn)闂蠲匪亍蠲奋蘸投錀蠲匪兀?，看相?yīng)出峰時(shí)間及峰面積的增大情況。

1.2.5 檢測(cè)分析方法驗(yàn)證 （1）精密度試驗(yàn)。選取標(biāo)曲系列Ⅰ、Ⅱ中間點(diǎn)濃度溶液連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)5次，考察各單體的峰面積，分析該方法的精密度。（2）重現(xiàn)性試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取10號(hào)莓茶試驗(yàn)樣品0.5 g 共5份，按試驗(yàn)方法進(jìn)行樣品檢測(cè)，分析該方法的重現(xiàn)性。（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)。①短期穩(wěn)定性。分別于標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ、Ⅱ配置后1、173、345、517和689 min（約11 h）取樣檢測(cè)，考察各單體峰面積的變化情況。②長(zhǎng)期穩(wěn)定性。分別于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制后當(dāng)天、1、2、3、4個(gè)月取標(biāo)曲系列Ⅰ、Ⅱ中間點(diǎn)濃度溶液進(jìn)行分析檢測(cè)，考察各單體峰面積的變化情況。（4）加標(biāo)回收試驗(yàn)。精確稱取10號(hào)試驗(yàn)樣品0.553 7 g，用30 mL70%甲醇超聲提取，提取液用初始流動(dòng)相按1：25稀釋；以試劑做空白樣，空白樣直接提取定容至25 mL；在試驗(yàn)樣品和空白樣中分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ、Ⅱ各10 mL，按試驗(yàn)方法檢測(cè)3種黃酮單體的加標(biāo)回收率。（5）檢測(cè)限試驗(yàn)。采用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)色譜峰形確定方法的上下檢測(cè)限。

1.2.6 樣品檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取莓茶粉碎樣品0.5 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g）至50 mL比色管中，先準(zhǔn)確加入15 mL70%甲醇水溶液潤(rùn)濕混勻，再準(zhǔn)確加入15 mL70%甲醇水溶液沿壁洗凈，稱重記數(shù)，混勻置于50℃超聲儀中超聲提取30 min，取出冷卻至室溫再次稱重，并用純甲醇補(bǔ)至超聲提取前的重量（即衡重衡定體積），混勻過(guò)0.45 μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)楊梅苷和楊梅素；另將超聲提取液用初始流動(dòng)相（乙腈∶0.1%磷酸水溶液=15∶85）進(jìn)行1∶10稀釋，混均過(guò)0.45 μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)二氫楊梅素；結(jié)果取平均值。

1.2.7 結(jié)果計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出所測(cè)樣品處理液中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素濃度含量。再按公式（1）計(jì)算樣品中黃酮單體含量。

其中，C為二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的含量；C’為樣品處理液中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素濃度（μg/mL），由峰面積值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程而得出；V為70%甲醇提取液體積數(shù)（mL）；1 000為單位換算系數(shù)；F為稀釋倍數(shù)；M為樣品稱樣量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種黃酮單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

由圖1可知，在62～620 μg/mL范圍內(nèi)二氫楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C’=0.018 1×S-2.761 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8；在7.5～75.00 μg/mL范圍內(nèi)楊梅苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C’=0.025 9×S-0.249 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9；在6.9～69.00 μg/mL范圍中楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C’=0.013 6×S-0.287 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。3種黃酮單體的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均接近1，且均在95%可置信區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明該方法適用于二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素3種黃酮單體的檢測(cè)。

圖1 3種黃酮單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 系統(tǒng)適用性考察

由表2可知，二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素3種黃酮單體的出峰時(shí)間分別為18.34、27.83和34.54 min，3種物質(zhì)出峰時(shí)間差距較大，不會(huì)相互影響；色譜柱理論塔板數(shù)n（即色譜柱的分離效能）分別為6 243、92 587和182 942，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4 000，說(shuō)明色譜柱分離效能高達(dá)液相色譜方法檢測(cè)要求；相鄰峰分離度R分別為2.785、2.267和2.707，均大于1.5，證明前后峰出峰不影響；拖尾因子T （即色譜峰的對(duì)稱性）分別為0.961、1.007和1.030，其值均在0.95～1.05之間，說(shuō)明色譜峰無(wú)拖尾峰形對(duì)稱。綜合分析得出該檢測(cè)方法系統(tǒng)適用性考察符合標(biāo)準(zhǔn)要求[25]。

表2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.3 樣品峰定性

由表3可知，序號(hào)1～3未加二氫楊梅素，其峰面積RSD值（n=3）為1.361 8%；序號(hào)2～4己加了楊梅素，其峰面積RSD值（n=3）為1.119 2%；序號(hào)1～2未加楊梅苷，其峰面積相對(duì)平均偏差為0.961 5%；序號(hào)3～4己加楊梅苷，其峰面積相對(duì)平均偏差為2.522 9%。RSD值或相對(duì)平均偏差均小于5%，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)穩(wěn)定；同時(shí)添加標(biāo)準(zhǔn)品前后各單體的峰形和相應(yīng)出峰時(shí)間均無(wú)變化，僅相應(yīng)峰面積增大，表明標(biāo)準(zhǔn)品定性溯源準(zhǔn)確。

表3 樣品峰定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度 由表4可知，3種黃酮單體連續(xù)進(jìn)樣時(shí)響應(yīng)值峰面積（即精密度）RSD值均小于5.0%，可見(jiàn)該檢測(cè)方法精密度很高，檢測(cè)儀器穩(wěn)定。

表4 精密度試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析（n=5）

2.4.2 重現(xiàn)性 由表5可知，莓茶樣品中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素重復(fù)檢測(cè)RSD值均小于5.0 %，說(shuō)明該試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

表5 重現(xiàn)性試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析（n=5）

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性 由表6可知，3種黃酮單體峰面積RSD值均小于 5.0 %，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在11 h內(nèi)穩(wěn)定不變，溶液穩(wěn)定性良好。由表7可知，3種黃酮單體的峰面積RSD值均小于5.0%，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能保持穩(wěn)定。

表6 標(biāo)準(zhǔn)溶液11 h穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

表7 標(biāo)準(zhǔn)溶液4個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.4.4 加標(biāo)回收率 試驗(yàn)結(jié)果顯示，空白樣中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的加標(biāo)回收率分別為101.415 6%、97.817 7%和90.052 2%；試驗(yàn)樣品中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的加標(biāo)回收率分別為97.542 7%、94.911 7%和90.182 1%；空白樣和試驗(yàn)樣品加標(biāo)回收率均在90%～105%之間，表明該檢測(cè)方法目標(biāo)物損失少、人為影響因素小、加標(biāo)回收率高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.4.5 上下檢測(cè)限 試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素檢測(cè)濃度分別約為775、130和120 μg/mL時(shí)，峰面積約為33 950 000、5 044 000和8 900 000 mAU*s，其色譜峰形開(kāi)始出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，峰對(duì)稱性變較差，峰頂現(xiàn)小饅頭峰，此濃度下浮20%確定為檢測(cè)上限濃度，分別為620、104和96 μg/mL；當(dāng)二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素檢測(cè)濃度分別約為3.1、3.75和3.45 μg/mL時(shí)，峰面積約為166 000、149 000和246 000 mAU*s，其色譜峰形較小，響應(yīng)值低，光譜圖不明顯，此濃度上浮20%確定為檢測(cè)下限濃度，分別為3.72、4.5和4.14 μg/mL。

2.5 樣品檢測(cè)

由表8可知，莓茶樣品中3種黃酮單體成分含量較高，其中二氫楊梅素含量在249.864～337.551 g/kg，楊梅苷和楊梅素含量分別為2.981 5～9.919 1和0.459 5～3.367 7 g/kg。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品定性、高效液相色譜儀外標(biāo)法定量、線性關(guān)系考察及方法學(xué)評(píng)價(jià)等過(guò)程建立了基于HPLC的二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素3種黃酮單體的同步測(cè)定方法。結(jié)果表明：二氫楊梅素在62～620 μg/mL范圍呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.999 8，精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性RSD均小于5%，加標(biāo)回收率在90%～105%；楊梅苷在7.5～75 μg/mL范圍呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.999 9，精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性RSD均小于5%，加標(biāo)回收率在90%～105%；楊梅素在6.9～69 μg/mL范圍呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.999 9，精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性RSD均小于5%，加標(biāo)回收率在90%～105%；用此法檢測(cè)12批次莓茶代用茶樣品，發(fā)現(xiàn)樣品中二氫楊梅素含量為249.864～337.551 g/kg；楊梅苷和楊梅素含量分別為2.981 5～9.919 9和0.459 5～3.367 7 g/kg。

用該方法可以同時(shí)完成莓茶代用茶中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素這3種黃酮單體的有效分離、正確定性和準(zhǔn)確定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，可以在莓茶代用茶質(zhì)量控制、藥物應(yīng)用研究、生產(chǎn)工藝研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用中加以應(yīng)用。