李秋梅,黎勝杰,王欣麗,劉 波,張廣娜,張 弛,高 遠(yuǎn),梅鶴平,王 蕓,*

1 山東省水土保持與環(huán)境保育重點實驗室,臨沂大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,臨沂 276000

2 臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院,臨沂 276000

3 山東省費(fèi)縣塔山國有林場,臨沂 273421

凋落物和根系向土壤中的有機(jī)物輸入是森林生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)的兩個途徑,輸入有機(jī)物的質(zhì)量和數(shù)量可影響土壤碳匯功能和生產(chǎn)力,也影響土壤微生物的碳源供給。土壤微生物在土壤肥力維持和有機(jī)物分解中起重要作用。高質(zhì)量(高營養(yǎng)、易分解)的有機(jī)物可被土壤微生物高效利用[1],而低質(zhì)量的有機(jī)物可能會導(dǎo)致土壤營養(yǎng)匱缺從而抑制微生物代謝[2]。有機(jī)物的數(shù)量和質(zhì)量影響土壤微生物活性[3],進(jìn)而導(dǎo)致不同碳轉(zhuǎn)化過程的差異。

凋落物輸入途徑和數(shù)量對土壤碳代謝功能的影響存在爭議。盡管有研究表明,添加凋落物抑制美國Andrews溫帶針葉林土壤有機(jī)碳分解[4],但一般而言,添加地上凋落物刺激土壤呼吸。盡管有研究表明,去除凋落物增加溫帶闊葉林土壤微生物量碳[5],但大多研究表明去除凋落物降低土壤呼吸[6],降低土壤微生物碳源代謝功能[2]。限制凋落物碳輸入(去除凋落物和無輸入)顯著減少土壤有機(jī)碳含量[7],降低土壤呼吸[8]。

根系所產(chǎn)生的根際沉積和根凋落物為土壤微生物的重要碳源[9]。根系輸入一方面通過土壤微生物群落更有效地合成與礦物相關(guān)的土壤有機(jī)碳[9],另一方面根際引發(fā)效應(yīng)加速土壤有機(jī)質(zhì)的分解[10]。去除根系降低土壤有機(jī)碳含量[7]。根系對細(xì)菌和真菌的影響不同,真菌更喜歡來源于根系的碳,而不是微環(huán)境中的碳；細(xì)菌只有在無可替代碳源的情況下,才加強(qiáng)對源于根的碳利用[11]。去除根系降低闊葉林和針葉林土壤微生物生物量[12],降低溫帶針葉林土壤有機(jī)碳分解[4]。去除根系降低栓皮櫟(Quercusvariabilis)人工林和黑松(Pinusthunbergii)人工林土壤微生物的碳源代謝功能[2]。去除根系降低土壤有機(jī)磷含量[13],進(jìn)而降低微生物碳代謝?？傊?去除根系會降低底物可利用性和有機(jī)碳的激發(fā)效應(yīng),導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化,但對微生物碳代謝功能的影響還存在爭議,并受環(huán)境條件的影響。

綜上所述,凋落物和根系對土壤微生物碳代謝功能的影響隨氣候帶(如亞熱帶和溫帶)、植被類型(如針葉林和闊葉林)改變而變化,對土壤微生物碳源代謝功能的影響還存在爭議[2]。鑒于凋落物和根系主要成分為碳,簡稱改變凋落物和根系輸入為改變碳輸入。

沂蒙山區(qū)位于溫帶的魯中南低山丘陵區(qū),其主要森林類型之一為櫟類次生林。本文期望揭示改變碳輸入途徑(地上與地下)、數(shù)量(凋落物倍增、凋落物去除與對照)對土壤微生物碳源代謝功能的定量影響,深化對溫帶天然次生林土壤有機(jī)碳代謝過程的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 樣地概況與樣品采集

試驗在山東省費(fèi)縣塔山國家森林公園(35°10′—36°00′ N, 117°35′—118°20′ E)開展。當(dāng)?shù)啬昃鶞?3℃,平均年降水量700 mm，土壤為棕壤。選取土地利用歷史相似、林齡約為40 a 的櫟類天然次生林(屬針闊混交林),于2014 年11 月開展凋落物添加/去除和根系去除定位控制試驗。試驗采取隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計,因素為改變碳輸入,共設(shè)置5 個處理,包括對照(不進(jìn)行任何處理)、凋落物倍增、去除凋落物、去除根系和無輸入處理(去除凋落物和根系),5 次重復(fù)。隨機(jī)選取5 個樣地,每個樣地上選取一個20 m × 30 m 的樣方。在每個樣方上設(shè)置5 個1.5 m × 1.5 m 的小樣方,每個小樣方隨機(jī)設(shè)置一個處理(表1),所有選取的小樣方內(nèi)均沒有喬木。凋落物添加/去除處理每月開展一次。根系去除處理每月開展一次,其中,夏季每月兩次。

表1 凋落物添加/去除和根系去除試驗描述

于定位實驗開展21 個月后,即于2016 年8 月13 日取土樣,取樣深度0—10 cm。在每個小樣方取5 個土鉆(分布在樣方四個角和中心,直徑3.5 cm)的土,混合為一個土樣。共取25 個土樣。土樣置于4℃冷藏箱運(yùn)回實驗室。一部分土樣用于4℃保存,過2 mm 篩,分析土壤微生物碳代謝功能；其余土樣風(fēng)干,分析理化性質(zhì)。

1.2 實驗室分析

土壤微生物碳代謝功能采用群落水平代謝圖譜法表征,用Biolog EcoPlateTM(Biolog Inc., Hayward, CA, USA) 測定[14]。取相當(dāng)于10 g 干土的新鮮土樣,加95 mL無菌的0.85%的NaCl溶液振蕩30 min,取稀釋1000 倍的150 μL土壤溶液接種至Biolog Eco 微平板中,每個土樣接種到一個微孔板上,即每個土樣接種3次。然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)240 h,每12 h于酶標(biāo)儀(Biotek, Synergy H1)上讀數(shù)1 次,波長為590 nm。

土壤有機(jī)碳含量采用元素分析儀測定(vario MACRO cube, Elementar, Germany)。土壤含水量采用烘干法。pH值采用1∶5 的土水比測試[15]。有效磷含量采用樹脂法[16],銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量采用1∶5 的KCl溶液提取,銨態(tài)氮采用水楊酸法測試[15],硝態(tài)氮采用雙波長紫外分光光度法測試[17]。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1土壤微生物碳代謝特征

用孔的平均顏色變化率(Average well color development，AWCD)來表征土壤微生物碳代謝特征[18]。AWCD越高,碳代謝能力越高。

(1)

式中,Ci是590 nm 處孔的吸光度。R是對照孔的吸光度。N是碳源的種類數(shù),此處為31。其中負(fù)的Ci-r設(shè)置為0[19]。

31 孔的AWCD均值隨時間t的變化,可用邏輯斯蒂增長方程來擬合[20]。

(2)

式中,K是AWCD 的理論最大值,s是達(dá)到最大值一半的時間,R是邏輯斯蒂增長曲線的指數(shù)斜率[20]。

由于96 h 是最接近達(dá)到AWCD最大值一半時間((93±2) h)的讀數(shù)時間,所以96 h 的吸光度值用來計算土壤微生物的碳代謝豐富度、多樣性和后續(xù)的冗余分析(Redundancy analysis, RDA)。

豐富度是在96 h 吸光度大于0.25 的碳源個數(shù)[21]。多樣性采用Shannon多樣性指數(shù)[22]。

H′=-∑piln(pi)

(3)

pi=ni/N

(4)

式中,ni為單個碳源吸光度,N為31 種碳源吸光度的和。

根據(jù)降解的相對難易程度,把Biolog Eco 微平板中的碳源分為六大類。其中,糖類、羧酸類和氨基酸類碳源歸為活性碳；胺類、聚合物類和其它類碳源歸為惰性碳。

1.3.2方差分析和冗余分析

采用單因素隨機(jī)區(qū)組方差分析改變碳輸入對土壤微生物碳源代謝功能的影響,多重比較采用Duncan法。冗余分析(Redundancy analysis,RDA)用于分析土壤微生物碳源代謝功能與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。因變量為31 種碳源在96 h 的吸光度,自變量為土壤理化性質(zhì),包含pH、含水量、有機(jī)碳含量、全氮含量、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、有效磷含量。用Monta-Carlo(999次)檢驗顯著影響土壤微生物碳源代謝的因子。Spearman相關(guān)分析用于分析土壤微生物碳源代謝多樣性與土壤因子之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 改變碳輸入對櫟類天然次生林土壤理化性質(zhì)的影響

去除根系處理和無輸入處理均顯著降低了土壤pH(P<0.05,表2)。凋落物倍增處理顯著增加了土壤有機(jī)碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量(P<0.05,表2),去除凋落物處理、去除根系處理和無輸入處理均顯著降低了土壤銨態(tài)氮含量(P<0.05)；改變碳輸入對土壤含水量、全氮、有效磷含量都沒有顯著影響(P>0.05)。

表2 改變碳輸入對沂蒙山區(qū)櫟類天然次生林土壤理化性質(zhì)的影響

2.2 改變碳輸入對櫟類天然次生林土壤微生物碳源代謝功能的影響

與對照相比,凋落物倍增處理增加櫟類天然次生林土壤微生物碳源代謝豐富度、碳源代謝多樣性和碳源代謝強(qiáng)度(圖1),但不顯著(P>0.05)。去除凋落物處理顯著降低土壤微生物碳源代謝豐富度和碳源代謝強(qiáng)度(P<0.05,圖1)。去除根系處理和無輸入處理都沒有顯著影響土壤微生物碳源代謝功能(P>0.05)。去除凋落物處理降低土壤微生物碳源代謝功能的幅度大于去除根系處理。

圖1 改變碳輸入對土壤微生物碳源代謝多樣性的影響

凋落物倍增處理增加了土壤微生物對糖類碳源的代謝豐富度,去除凋落物處理、去除根系處理和無輸入處理均降低了糖類的代謝豐富度,都不顯著(P>0.05,表3)。無輸入處理顯著降低了胺類碳源的代謝豐富度(P<0.05)。其余處理對羧酸類、氨基酸類、聚合物類和其它類碳源代謝豐富度影響都不顯著(P>0.05)。

表3 改變碳輸入對土壤微生物六大類碳源代謝豐富度的影響

表4 改變碳輸入對土壤微生物六大類碳源代謝Shannon多樣性指數(shù)的影響

表5 改變碳輸入對土壤微生物六大類碳源代謝強(qiáng)度的影響

圖2 改變碳輸入處理下微生物碳源代謝多樣性與土壤因子之間的冗余分析

2.3 改變碳輸入對櫟類天然次生林土壤微生物碳源代謝功能的影響途徑

土壤有機(jī)碳和銨態(tài)氮含量顯著影響不同凋落物輸入途徑和數(shù)量變化條件下土壤微生物碳源代謝多樣性,兩者解釋了土壤微生物碳源代謝多樣性變異的 27.4% (F=5.06,P=0.001,圖2),其中軸1 解釋了24.0%的變異(F=8.45,P=0.001),軸2解釋了3.4%的變異(F=1.79,P=0.086)。土壤微生物的碳源代謝豐富度、多樣性、強(qiáng)度與土壤有機(jī)碳和銨態(tài)氮含量都顯著正相關(guān)(P<0.05,表6)。凋落物倍增處理在銨態(tài)氮和有機(jī)碳含量增加的方向。去除凋落物處理、無輸入處理都位于銨態(tài)氮和有機(jī)碳含量減少的方向(圖2)。這表明凋落物倍增處理通過增加土壤銨態(tài)氮和有機(jī)碳含量(表2),增加土壤微生物碳源代謝功能,去除凋落物和無輸入處理通過降低土壤銨態(tài)氮和有機(jī)碳含量(表2),降低土壤微生物碳源代謝功能。

表6 碳源代謝多樣性與土壤因子之間的秩相關(guān)分析

3 討論

3.1 改變碳輸入對土壤微生物碳源代謝功能的影響

本研究中,凋落物倍增處理輕微增加土壤微生物碳源代謝Shannon多樣性。盡管有研究表明凋落物倍增降低針葉林土壤微生物代謝活性[4],但綜合本研究和大量國內(nèi)外相關(guān)研究[2],凋落物倍增增加針闊混交林土壤微生物代謝活性。本研究中,凋落物倍增處理增加土壤微生物對糖類和胺類的代謝能力,降低對羧酸類、氨基酸類和聚合物類的代謝能力。凋落物倍增對針葉林土壤活性碳代謝能力(如糖類、淀粉、羧酸類、纖維素等代謝或代謝相關(guān)土壤酶活性(β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、纖維二糖酶等)或基因多樣性)的影響爭議較大[2, 23],但降低對惰性碳的代謝能力(如胺、聚合物、幾丁質(zhì)、角質(zhì)、木質(zhì)素等代謝或代謝相關(guān)土壤酶活性(芳基硫酸酯、β- 1, 4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶、酚氧化酶、過氧化物酶等)或基因多樣性)[2]。盡管有研究表明凋落物倍增降低闊葉林土壤微生物活性碳代謝,增加惰性碳代謝[24],但本研究和大多研究[25-26]都表明凋落物倍增處理增加針闊混交林土壤微生物活性碳代謝,降低惰性碳代謝。森林土壤微生物代謝基因會隨凋落物輸入的質(zhì)量而變化,當(dāng)外界輸入復(fù)雜的有機(jī)物,土壤微生物基因更傾向于代謝復(fù)雜的有機(jī)物[2]。

本研究中,去除凋落物顯著降低微生物碳源代謝能力。盡管有研究表明,去除凋落物增加針葉林和闊葉林土壤微生物生物量[5],但更多研究表明,去除凋落物降低針葉林和闊葉林土壤微生物量[27]、碳代謝活性[2,26]。本研究中,去除凋落物處理顯著降低土壤微生物的活性碳代謝能力。盡管有研究發(fā)現(xiàn)去除凋落物顯著增加活性碳代謝[24],但大多研究表明去除凋落物顯著降低活性碳代謝,如顯著降低栓皮櫟人工林土壤微生物的羧酸類、淀粉代謝,顯著降低黑松人工林土壤羧酸類的代謝[2],降低闊葉林土壤β-葡萄糖苷酶活性[25-26]。盡管有研究發(fā)現(xiàn),去除凋落物處理顯著增加闊葉林土壤惰性碳代謝[24],但大多研究表明去除凋落物顯著降低惰性碳代謝[2,28]。本研究和其它大多研究表明,去除凋落物降低針闊混交林土壤微生物碳代謝能力。這可能是去除凋落物減少向土壤中的有機(jī)物輸入,降低微生物可利用底物。

本研究中,去除根系處理輕微降低土壤微生物碳源代謝能力。盡管有研究表明,去除根系增加美國Andrews針葉林中土壤微生物生物量[27],但大多研究表明去除根系降低土壤微生物碳代謝功能[2,29]。本研究中去除根系處理降低土壤微生物對六大類碳源的代謝能力。大多研究表明,去除根系降低活性碳庫代謝[2]。在闊葉林中,去除根系顯著降低土壤β-葡萄糖苷酶活性[26-27]。去除根系降低惰性碳庫的利用或與惰性碳庫相關(guān)酶的活性,例如降低黑松人工林中土壤微生物的胺類和聚合物類碳源代謝能力[2]。根系分泌物如糖類、氨基酸、酶、脂肪族和芳香族等化合物,可作為營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)微生物生長[30],而根系分泌物中的酚類物質(zhì)會抑制土壤微生物活性。根系共生的菌根真菌儲存了大量光合固定的碳[3]。本研究和其它大多研究表明,去除根系降低土壤微生物碳源代謝功能。

本研究中,無輸入處理降低了土壤微生物碳源代謝能力。盡管在美國Andrews針葉林中無輸入處理增加土壤微生物生物量[27],但本研究與其他大多研究表明,無輸入處理降低土壤碳代謝功能[2,26]。同時去除凋落物和根系,土壤微生物代謝受可利用底物限制[31],碳代謝功能降低。

本研究中,去除凋落物處理降低微生物碳源代謝功能的幅度大于去除根系處理,表明在控制實驗開展21 個月的時間內(nèi),凋落物對沂蒙山區(qū)次生林土壤微生物碳源代謝功能的影響大于根系。溫帶落葉闊葉林中,根系對土壤呼吸的影響大于凋落物[32],根系對針葉林土壤有機(jī)碳含量的影響大于凋落物[3]。去除根系降低我國亞熱帶針葉林(側(cè)柏(Platycladusorientalis)人工林)土壤有機(jī)碳的程度大于去除凋落物[33]。原因為去除根系降低土壤大團(tuán)聚體含量及其中的有機(jī)碳含量并減少大團(tuán)聚體的粘合劑-真菌生物量；而去除凋落物未引起上述土壤屬性變化[33]。與地上碳輸入相比,土壤微生物能更有效的利用地下碳輸入形成穩(wěn)定的土壤有機(jī)碳[34]。但在我國亞熱帶闊葉林(厚夾相思(Acaciacrassicapa)林和尾葉桉(Eucalyptusurophylla)林)中,從生物量和分解所產(chǎn)生的碳來說,凋落物對土壤有機(jī)碳含量的影響大于根系[7]。在熱帶人工林,凋落物對土壤呼吸和微生物生物量的影響大于根系,而在次生林中則相反[35]。凋落物和根系對土壤微生物碳代謝的影響隨林型和溫度帶而變化。

需要指出的是,本研究采用挖壕溝法去除根系,殘留根系大部分未降解[36],會增加微生物可利用的碳源,進(jìn)而增加微生物碳代謝能力。由于殘留根系中不同化學(xué)成分降解速率不同[37],且不同根系粗細(xì)[37]和級別[36]分解速率不同,如細(xì)根比粗根養(yǎng)分含量高[38]但分解慢[37],難以對碳源代謝能力的影響定量化?？紤]到壕溝里殘留根系的貢獻(xiàn),凋落物和根系對土壤微生物碳代謝能力的相對影響可能會發(fā)生變化,未來的研究需要考慮到殘留根系對土壤微生物碳源代謝的貢獻(xiàn)。

3.2 改變碳輸入條件下土壤碳源代謝的影響因素

冗余分析表明,土壤有機(jī)碳和銨態(tài)氮含量顯著影響不同碳輸入處理條件下土壤微生物碳源代謝多樣性。有研究表明,土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量顯著影響黑松人工林中不同碳輸入條件下土壤微生物碳源代謝功能多樣性[2]；而土壤速效磷、含水量顯著影響栓皮櫟人工林中不同碳輸入條件下微生物碳源代謝功能多樣性[2]。這與改變碳輸入處理下,不同林型下土壤微生物代謝的影響因子不同有關(guān)。

冗余分析圖中,凋落物倍增處理分布在土壤銨態(tài)氮和有機(jī)碳含量增加的方向,這表明凋落物倍增處理通過顯著增加土壤有機(jī)碳和銨態(tài)氮含量(表2),改變土壤微生物碳源代謝圖譜(圖2),并增加微生物碳源代謝功能(表6)。去除凋落物處理、無輸入處理都位于土壤銨態(tài)氮和有機(jī)碳減少的方向(圖2),這表明這兩個處理通過降低土壤有機(jī)碳和銨態(tài)氮含量(表2),改變微生物碳源代謝圖譜(圖2),降低微生物碳源代謝功能(表6)。凋落物倍增為微生物生長活動提供了碳源和氮源,刺激土壤微生物活性[39],如凋落物倍增增強(qiáng)華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)人工林土壤呼吸[40]。沂蒙山區(qū)櫟類天然次生林是針闊混交林,葉凋落物碳氮比為40,而低碳氮比有利于提高土壤有機(jī)氮凈礦化速率[41],增加微生物碳源代謝能力。去除凋落物阻斷了地上有機(jī)物輸入,減少了碳源輸入,降低微生物碳源代謝功能。

4 結(jié)論

采用Biolog Eco微平板培養(yǎng)法,研究改變碳輸入對沂蒙山區(qū)櫟類次生林土壤微生物碳源代謝功能的影響。結(jié)果表明,凋落物倍增處理增加了土壤微生物碳源代謝功能,增加了對糖類和胺類的利用能力。去除凋落物處理、去除根系處理、無輸入處理降低了土壤微生物的碳源代謝功能。凋落物對土壤微生物碳源代謝能力的影響大于根系。土壤有機(jī)碳含量、銨態(tài)氮含量顯著影響微生物碳源代謝多樣性(P<0.05),并與碳源代謝功能正相關(guān)。這表明凋落物倍增處理通過顯著增加土壤有機(jī)碳含量和銨態(tài)氮含量(P<0.05),改變土壤微生物碳源代謝圖譜,增加土壤微生物碳源代謝功能。去除凋落物處理、無輸入處理通過降低土壤有機(jī)碳含量和銨態(tài)氮含量,改變微生物碳源代謝圖譜,降低微生物碳源代謝功能。結(jié)果深化了改變碳輸入途徑(地上凋落物與地下根系)、數(shù)量(凋落物倍增、去除凋落物與對照)對溫帶櫟類天然次生林土壤微生物碳代謝過程的認(rèn)識。