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      酵母甘露聚糖(20 kDa)的生物安全性及體內(nèi)分布研究

      2021-07-13 06:32:42付乾振王佳奇王子朝張慧茹
      關(guān)鍵詞:聚糖酵母多糖

      付乾振,王佳奇,樊 坤,劉 潔,王子朝,張慧茹

      河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001

      多糖具有抗癌、抗氧化、提高免疫力[1-3]等作用,并且能輔助治療腎臟、胃腸道、肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。多糖的藥理學(xué)作用研究起步較晚,主要局限于多糖的生物效應(yīng)[4-5],對(duì)其藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究較少[6]。多糖是親水性大分子,其體內(nèi)分布吸收和作用機(jī)制有待完善[7]。此外,已有研究表明,分子量也是影響多糖生物活性的主要因素之一[8-9],大多數(shù)用于抗癌藥物前體的多糖分子質(zhì)量為25~50 kDa,與多糖的抗癌活性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為密切相關(guān)[10],并且不同分子量的多糖在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出不同的組織分布[11]。因此,以分子量為切入點(diǎn),研究低分子量多糖的體內(nèi)穩(wěn)定性和藥物吸收代謝分布,有助于了解多糖在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制。

      酵母甘露聚糖的主鏈由甘露糖以α-1,6糖苷鍵形成的長(zhǎng)鏈組成,是酵母細(xì)胞壁外層具有多種生物活性的多糖聚合物,是目前發(fā)現(xiàn)的免疫功能最強(qiáng)的細(xì)胞壁多糖,能顯著增加機(jī)體免疫力、刺激腸道益生菌生長(zhǎng)、抑制和減少病原菌等[12-13]。因此,以酵母甘露聚糖為實(shí)驗(yàn)材料,研究其生物安全性及在小鼠體內(nèi)的吸收及分布情況,為低分子量酵母甘露聚糖在食品醫(yī)療等領(lǐng)域的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      酵母甘露聚糖:西安百川生物科技有限公司;磷酸緩沖液、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、二甲基亞砜、葡萄糖:上海麥克林生化科技有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽:上海阿拉丁生化科技有限公司;抗凝劑、生理鹽水:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司;胰酶、乙二胺四乙酸、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合物:賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      GA-3血糖儀:上海羅氏制藥有限公司;TDL-5-A離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;BDF-86V158超低溫冰箱:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;YS-840-2超凈工作臺(tái):上海箐海儀器有限公司;BCD-221EMK3A冰箱:河南新飛電器有限公司;Well scan MK Ⅱ酶標(biāo)儀:美谷分子儀器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州億通分析儀器制造有限公司;XSP-15TZ倒置顯微鏡:上海光學(xué)儀器廠;FA1 004 N電子天平:上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 體外生物安全性檢測(cè)

      1.3.1.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)

      參照姜宏偉[14]的方法并稍加改進(jìn)。取10 mL胎牛血清、1 mLL-谷氨酰胺、1 mL非必需氨基酸、1 mL青鏈霉素混合液于87 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌,作為完全細(xì)胞培養(yǎng)液。用完全細(xì)胞培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為10、20、40、80、160 μg/mL的酵母甘露聚糖溶液。

      取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞消化離心,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù),96孔板中每孔接種8 000個(gè)Caco-2細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)液,PBS洗兩次。每孔加入不同質(zhì)量濃度梯度的多糖溶液200 μL,每個(gè)梯度設(shè)5個(gè)重復(fù),用不含多糖的細(xì)胞培養(yǎng)液做空白對(duì)照。于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后,加MTT(5 mg/mL,pH 7.4)20 μL繼續(xù)孵育4 h。小心吸取孔中所有液體后加入150 μL DMSO,振蕩10 min后,檢測(cè)490 nm處溶液的吸光度。

      細(xì)胞增殖率=OD1/OD2×100%,

      式中:OD1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度;OD2為空白對(duì)照組的吸光度。

      1.3.1.2 酵母甘露聚糖的溶血性檢測(cè)

      參照樊坤等[15]的方法并稍加改進(jìn)。取小鼠血加入肝素鈉抗凝管,上下輕輕混勻,加生理鹽水,1 000 r/min離心10 min,棄去上清液及白細(xì)胞層,再用生理鹽水沖懸紅細(xì)胞,重復(fù)離心3次。用生理鹽水配制20%紅細(xì)胞母液。精確稱取1 mg酵母甘露聚糖,溶于1 mL生理鹽水,得到1 mg/mL多糖母液。

      在微量離心管中分別加入40、32、24、16 μL多糖母液,均與10 μL紅細(xì)胞母液混合均勻,用生理鹽水補(bǔ)足至200 μL,得到質(zhì)量濃度為200、160、120、80 μg/mL的多糖、紅細(xì)胞反應(yīng)體系。陰性對(duì)照用生理鹽水190 μL與10 μL紅細(xì)胞母液混勻,陽(yáng)性對(duì)照用190 μL蒸餾水與10 μL紅細(xì)胞母液混勻。各組均設(shè)置5個(gè)重復(fù)。置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min后,離心2 min,吸取100 μL上清液于96孔酶標(biāo)板中,檢測(cè)540 nm處的吸光度。

      溶血率=(OD1-OD3)/(OD2-OD3)×100%,

      式中:OD1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度;OD2為陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度;OD3為陰性對(duì)照組的吸光度。

      1.3.2 多糖體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

      1.3.2.1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

      參照李傳民[16]的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法,配制質(zhì)量濃度為100 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,將其分別稀釋為0.012、0.024、0.048、0.097、0.195、0.390、0.780、1.560、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/mL的溶液,將梯度稀釋的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用苯酚-硫酸法反應(yīng)20 min后進(jìn)行測(cè)定。以蒸餾水溶液為空白對(duì)照,于490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得線性回歸方程,計(jì)算腸道、內(nèi)臟組織中的糖含量。

      1.3.2.2 小鼠灌服及血糖含量測(cè)定

      購(gòu)買個(gè)體勻稱、發(fā)育良好的SPF級(jí)KM小鼠(來(lái)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(豫)2017-0001)若干,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)3~5 d使其適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)前一天晚上對(duì)小鼠進(jìn)行斷食、不斷水處理。第二天稱質(zhì)量、分組,小鼠體重在24~26 g之間。實(shí)驗(yàn)組按照100 mg/kg小鼠體重的劑量灌服多糖,空白組灌服等量生理鹽水。灌服后,于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min,用GA-3血糖儀檢測(cè)血糖值。

      1.3.2.3 小鼠臟器糖含量的測(cè)定

      分別于灌服后1、2、3 h,取空白組和實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行解剖,取心、肝、脾、肺、腎等臟器,稱質(zhì)量后,取心臟0.15 g、肝臟0.50 g、脾臟0.07 g、肺0.20 g、腎0.40 g于離心管中,與1 mL蒸餾水研磨混勻離心(12 000 r/min、10 min)之后,收集上清液。利用苯酚-硫酸法檢測(cè)各臟器中糖含量。以空白小鼠的臟器糖含量做對(duì)照,計(jì)算各臟器中的糖量,分析多糖隨時(shí)間在各臟器中的分布情況。

      1.3.2.4 小鼠腸道糖含量的測(cè)定

      灌服后,每隔30 min(即灌胃后的30、60、90 min)解剖小鼠。取含腸內(nèi)容物的十二指腸、空腸、回腸于離心管中,取十二指腸0.15 g、空腸0.50 g、回腸0.30 g,與1 mL蒸餾水混勻離心(12 000 r/min、10 min)之后,收集上清液。利用苯酚-硫酸法檢測(cè)各腸段中糖含量,以空白小鼠的腸道做對(duì)照組,計(jì)算殘留在腸道中未吸收的糖量,分析多糖隨時(shí)間在腸道中的流動(dòng)和分布情況。

      1.3.3 統(tǒng)計(jì)與分析

      實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010整理后,采用SPSS軟件進(jìn)行ANONA顯著性檢驗(yàn),并采用Duncan多重比較,分析各組之間的差異性。P<0.05表明差異顯著,P<0.01表明差異極顯著。使用Origin軟件作圖。

      2 結(jié)果和討論

      2.1 酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞的毒性

      采用MTT方法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的酵母甘露聚糖對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果如表1所示。不同質(zhì)量濃度的酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯影響(P>0.05)。當(dāng)酵母甘露聚糖的質(zhì)量濃度為10、80 μg/mL時(shí),細(xì)胞的增殖率分別為97.17%和98.98%,其他質(zhì)量濃度的酵母甘露聚糖則對(duì)細(xì)胞有輕微的促增殖作用,當(dāng)質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí),對(duì)細(xì)胞的增殖率促進(jìn)效應(yīng)最強(qiáng),為115.60%,說(shuō)明酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞不僅無(wú)毒,還有輕微的促增殖作用。

      表1 酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of mannan on the proliferation of Caco-2 cells

      2.2 酵母甘露聚糖的溶血性檢測(cè)

      酵母甘露聚糖的溶血性變化如圖1所示。圖1表明:糖質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞溶血性影響較大(P<0.01)。多糖質(zhì)量濃度為80、160、200 μg/mL,溶血率均為負(fù)值,略有凝血作用,多糖質(zhì)量濃度為120 μg/mL時(shí),溶血性為正值,但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典中規(guī)定的5%的溶血性,符合生物使用安全。因此,當(dāng)該多糖溶液進(jìn)入血液時(shí),對(duì)機(jī)體無(wú)溶血性影響。

      注:**表示差異顯著(P<0.01)。圖1 酵母甘露聚糖的溶血性變化Fig.1 Hemolytic change of mannan

      2.3 葡萄糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

      葡萄糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的線性回歸方程:y=0.022 7x+0.050 7,R2=0.988 7。根據(jù)該方程計(jì)算腸道、臟器中的糖含量。

      圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for glucose

      2.4 酵母甘露聚糖對(duì)血糖的影響

      酵母甘露聚糖對(duì)血糖的影響見圖3。由圖3可知,實(shí)驗(yàn)組和空白組的初始血糖值為3~4 mmol/L,空白組的血糖含量在前105 min時(shí)始終明顯低于實(shí)驗(yàn)組。灌胃酵母甘露聚糖后,實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖迅速上升,至45 min達(dá)到高峰,其原因可能為酵母甘露聚糖進(jìn)入胃腸中后,被腸道酶分解、吸收入血,導(dǎo)致的血糖迅速升高,而后在胰島素的作用下血糖逐漸降低。部分酵母甘露聚糖進(jìn)入胃腸道,這與Hu等[17]研究亞洲車前草多糖的消化情況具有相似性。而Li等[18]在研究鐵皮石斛多糖口服后,發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖并不能被胃腸道消化吸收,主要調(diào)節(jié)腸道菌群。

      圖3 小鼠血糖變化Fig.3 Change of blood glucose in mice

      2.5 酵母甘露聚糖對(duì)小鼠內(nèi)臟糖含量的影響

      由圖4可知,血流量較大的肝臟中糖含量明顯高于其他臟器。在灌胃后1 h,肝糖含量明顯升高,而后逐漸下降;肺組織中糖含量也有類似的趨勢(shì);腎臟中糖含量明顯高于心臟的糖含量,但腎和心臟中糖含量隨時(shí)間的變化不大;脾中的糖含量隨時(shí)間下降。

      圖4 小鼠內(nèi)臟糖含量的分布變化Fig.4 Change of sugar content in mice organs

      由圖5可知:內(nèi)臟中糖含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少;灌胃后1 h,內(nèi)臟糖含量提高,隨后逐漸下降;肝臟中的糖含量是所有內(nèi)臟中糖含量最高的,這與鄭子明[19]在研究香菇多糖的藥物代謝動(dòng)力學(xué)時(shí),具有相似性。多糖進(jìn)入血液后,迅速集聚于肝臟,導(dǎo)致肝臟中糖含量較高。推測(cè)是酵母甘露聚糖形成了肝糖原儲(chǔ)存在肝臟中,這還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

      圖5 小鼠內(nèi)臟糖含量變化Fig.5 Distribution of total glucose content in mice organs

      2.6 酵母甘露聚糖在小鼠腸道中的流動(dòng)變化

      由圖6可知,十二指腸中的糖含量總是低于空腸和回腸,可能是糖快速流過(guò)十二指腸,所以殘存在十二指腸的糖含量較低;隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推進(jìn),糖到達(dá)空腸,灌服30 min后空腸中糖含量較高,直至60 min左右時(shí),酵母甘露聚糖到達(dá)回腸,造成回腸的糖含量升高。有研究報(bào)道,糖類化合物在腸道消化吸收的主要部位是空腸和回腸[20]。因此推測(cè)酵母甘露聚糖通過(guò)口服被腸道吸收后,其主要吸收?qǐng)鏊强漳c和回腸。

      圖6 小鼠腸道糖含量變化Fig.6 Change of sugar content in mice intestine

      由圖7可知:灌胃后30 min腸道糖含量增加,60 min腸糖含量最低,90 min反而稍有升高。推測(cè)腸道糖含量的變化是幾個(gè)糖去向的總和:①?gòu)哪c黏膜將糖吸收入血,減少腸道中糖含量;②未吸收的糖仍能少量增加腸糖含量;③可能存在類似藥物外排機(jī)制的多糖外排效應(yīng),從腸道細(xì)胞中外排多糖到腸腔中。結(jié)合血糖變化認(rèn)為:酵母甘露聚糖(20 kDa)一部分可在腸道被吸收入血,分布在各臟器;另一部分隨腸道流動(dòng)到空腸、回腸,排到盲腸、結(jié)腸,可能參與腸道菌群益生菌群的調(diào)節(jié)[21],這也是下一步實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容。

      圖7 小鼠腸道中糖含量變化Fig.7 Distribution of total sugar content in mice intestine

      3 結(jié)論

      研究結(jié)果表明:酵母甘露聚糖(20 kDa)有輕微促進(jìn)細(xì)胞增殖作用;對(duì)細(xì)胞溶血率均在生物安全范圍內(nèi)。酵母甘露聚糖(20 kDa)具有明顯的升高血糖的作用,在45 min時(shí)血糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值,然后降低;吸收入血后分布于各個(gè)器官,肝臟的糖含量始終較高;腸道中酵母甘露聚糖隨腸道流動(dòng),主要在回腸和空腸部分被吸收。研究結(jié)果有助于了解多糖在機(jī)體內(nèi)的吸收分布機(jī)制,為多糖的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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