基于微生物群落特征解析的生物活性炭氨氧化機制

黃怡婷, 陳之歆, 魏忠慶, 鄭 奮, 牛 佳, 劉鴻浩, 莊婉娥, 徐開欽

(1.福建工程學院生態(tài)環(huán)境與城市建設(shè)學院水科學與水質(zhì)保障工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350118； 2.福州市水務(wù)投資發(fā)展有限公司，福建 福州 350001；3.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；4.日本國立環(huán)境研究所資源循環(huán)與廢棄物研究中心，日本 筑波 305-8506)

氨氮是地表水水源污染的主要指標之一，農(nóng)業(yè)污染源的氨氮排放量占地表水體污染總負荷的22.4%[1].隨著國家對保障農(nóng)村飲用水安全的重視以及對城鄉(xiāng)供水一體化的大力推進[2]，如何提高農(nóng)村飲用水水質(zhì)，解決微污染水源中的氨氮問題，成為供水行業(yè)亟待解決的首要問題[3].

近年來，臭氧—生物活性炭(ozone-biological activated carbon, Ozone-BAC)技術(shù)被認為是降低水中氨氮濃度、提高飲用水水質(zhì)的行之有效的技術(shù)之一，該技術(shù)已在歐洲、日本等發(fā)達國家的多個地區(qū)被廣泛應(yīng)用.在我國氨氮濃度較高的東南沿海地區(qū)該技術(shù)也已得到逐步推廣.然而，BAC在實際運行過程中未能有針對性地解決水源水質(zhì)問題.目前國內(nèi)對BAC的研究也主要集中在參數(shù)調(diào)整、處理效果監(jiān)測等方面[4,5]，缺乏對其主要功能機理的闡述，使得對BAC的改進和優(yōu)化較為盲目.

研究發(fā)現(xiàn)氨氧化作用主要依靠兩大類氨氧化微生物[6,7]來實現(xiàn)，即氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)[8,9]，二者在不同環(huán)境下的存在數(shù)量不同，且對營養(yǎng)物質(zhì)存在競爭性生長[7,10,11].然而，我國飲用水處理中BAC上是否同時存在這兩種類型微生物、它們與其它微生物之間的關(guān)系以及對BAC氨氧化的貢獻等問題尚不明確.

高通量測序技術(shù)[12]能夠最大程度地反映樣品中微生物群落的整體情況.另外針對目標功能微生物的T-RFLP技術(shù)以及Q-PCR技術(shù)可以通過引物設(shè)計，針對性地研究特定微生物的多樣性，進一步揭示其主要功能.

基于此，本研究通過對水廠實際運行的BAC進行硝化潛勢測定和微生物群落特征解析，并比較了BAC上和濾池水中的微生物群落特征，以期從微觀角度闡明其氨氧化機理，為進一步改進和優(yōu)化BAC提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

BAC和活性炭濾池中的水樣于2019年1月采自國內(nèi)某自來水廠.該水廠水處理工藝為“臭氧+上向流BAC濾池+砂濾+氯消毒”，其中臭氧投加濃度為1.2 mg·L-1，臭氧接觸時間為10 min，BAC已投入使用1年，其基本參數(shù)如表1所示.

表1 活性炭的基本參數(shù)Table 1 Characteristics of biological activated carbon

1.2 硝化潛勢測定

將濕重為20 g的BAC樣品放入滅菌后的錐形瓶，加入250 mL含有1.4 mg·L-1氨氮的無機培養(yǎng)基.無機培養(yǎng)液的成分包括4 mg·L-1KH2PO4、84 mg·L-1NaHCO3、50 mg·L-1MgSO4·7H2O、20 mg·L-1CaCl2·2H2O和微量元素混合液，pH調(diào)節(jié)為7.5，設(shè)置3個平行和1個對照組.硝化潛勢測定：將上述處理置于20 ℃、50 r·min-1的恒溫搖床中，反應(yīng)24 h，定期(0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24 h)收集上清液，并通過0.22 μm的濾膜(津騰公司)收集保存.培養(yǎng)結(jié)束后測定上清液中的氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮.通過吲哚酚藍比色法測定水中的氨氮濃度，使用離子色譜儀(Thermo Fisher Scientific公司提供)進行硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的測定.硝化潛勢的計算公式[13]表示如下：

1.3 活性炭和水樣中微生物群落

1.3.1 樣品處理及DNA提取 取適量活性炭樣品，加入一定量的1×PBS溶液后用GL-88B旋渦混合器振蕩，將表面菌體洗入液體中；將洗后液體在12 000 r·min-1下離心2 min，提取沉淀.500 mL原位采集的水樣通過0.22 μm PTFE膜過濾(Advantec公司提供)，濾膜樣品經(jīng)液氮冷凍，用組織破碎儀破碎，將破碎后的濾膜裝入2 mL離心管中.活性炭樣品和水樣均用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA公司產(chǎn)品)進行DNA提取，并對提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.3.2 細菌和古菌群落的Illumina MiSeq高通量測序分析 BAC和水樣均進行細菌和古菌的V3-V4區(qū)擴增.樣品細菌共擴增兩輪，第1輪采用Nobar_341F(序列為“CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG”)和Nobar_805R(序列為“GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC”)作為引物進行擴增.PCR擴增程序為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，共5個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共20個循環(huán)；72 ℃延長5 min，最后保持在10 ℃.第2輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物，擴增程序為95 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共5個循環(huán)；72 ℃延長5 min，最后保持在10 ℃.

樣品古菌引用巢式PCR擴增，共3輪.第1輪使用GU1ST-340F(序列為“CCCTAYGGGGYGCASCAG”)和GU1ST-1000R(序列為“GGCCATGCACYWCYTCTC”)作為引物進行擴增.第2輪采用349F(序列為“CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN GYGCASCAGKCGMGAAW”)和806R(序列為“GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT”)作為引物進行擴增.前兩輪的PCR程序均為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，共5個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共20個循環(huán)；72 ℃延長5 min，最后保持在10 ℃.第3輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物，擴增程序與細菌相同.

各樣本測序序列通過獨特的標簽序列區(qū)分，區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾.采用UCLUST算法，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU(operational taxonomic units)聚類，選擇豐度最高的序列計算Alpha多樣性指數(shù).通過R語言分析做出樣品OTU分布韋恩圖，利用Excel做出優(yōu)勢物種相對豐度柱狀圖，利用FAPROTAX數(shù)據(jù)庫對樣品進行功能注釋預測.

1.4 氨氧化古菌和細菌的群落

1.4.1 氨氧化古菌和細菌的amoA基因的實時熒光定量PCR分析 采用SYBR熒光染料法對氨氧化微生物功能基因(amoA基因)進行實時熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction, Q-PCR)分析.AOA的amoA基因擴增引物為Arch-amoAF(序列為“STAATGGTCTGGCTTAGACG”)和Arch-amoAR(序列為“GCGGCCATCCATCTGTATGT”)[14].PCR擴增程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共50個循環(huán)，然后進行溶解曲線檢測.amoA基因克隆NG-B-081028_K1(accession No. AB550804)作為古菌的內(nèi)參基因.

AOB的amoA基因擴增引物為amoA1F*(序列為“GGGGHTTYTACTGGTGGT”)和amoA2R(序列為“CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC”)[15].PCR擴增程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，80 ℃ 5 s，共50個循環(huán)，然后進行溶解曲線檢測.NitrosomonaseuropaeaATCC 19718的amoA基因作為細菌的內(nèi)參基因.

1.4.2 氨氧化古菌和細菌的amoA基因的末端限制性片段長度多樣性分析 通過末端限制性片段長度多樣性(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)比較分析活性炭和水樣中的氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)，利用與Q-PCR相同的引物進行擴增，即AOA的amoA基因擴增引物為Arch-amoAF和Arch-amoAR, AOB的amoA基因擴增引物為amoA1F*和amoA2R[6].對其中Arch-amoAF和amoA1F*的5′ 端被6-羧基熒光素(6-FAM)進行標記；并采用10 U HhaⅠ(內(nèi)切酶)處理古菌的amoA基因，用10 U TaqⅠ(內(nèi)切酶)處理細菌的amoA基因[6]；最后通過測序儀(美國ABI提供)對片段進行測序，通過Genemapper軟件分析T-RFLP數(shù)據(jù).大于50 bp的基因片段用于微生物多樣性分析.

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用單因素方差分析對氨氧化微生物數(shù)量進行統(tǒng)計分析，通過IBM SPSS Statistics 26軟件得出結(jié)果.

圖1 BAC硝化潛勢Fig.1 Nitrification potential of biological activated carbon

2 結(jié)果與分析

2.1 BAC硝化潛勢

硝化潛勢指BAC在氨氮濃度充足、最適條件下所能氧化氨氮的能力.硝化潛勢測定過程中溶液氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的濃度隨時間的變化情況如圖1所示.BAC硝化潛勢的計算結(jié)果為0.013 8 mg·L-1·h-1·g-1(干重).培養(yǎng)24 h后氨氮濃度從最初的1.22 mg·L-1降低到0.64 mg·L-1，硝態(tài)氮濃度從0.30 mg·L-1升高到2.80 mg·L-1，沒有檢測到亞硝態(tài)氮.

2.2 BAC和濾池水樣中微生物群落

2.2.1 BAC和濾池水樣中微生物的多樣性 通過Illumina測序?qū)υ夹蛄羞M行數(shù)據(jù)預處理，結(jié)果如表2所示.BAC及濾池的水樣分別用TB和TW表示，兩種樣品得到的細菌優(yōu)質(zhì)序列數(shù)分別為48 298和62 711，古菌優(yōu)質(zhì)序列數(shù)分別為58 272和63 620.將這些序列在97%的相似性水平下進行聚類分析，從而得出每個樣本中細菌和古菌的OTU數(shù)量.從表2可以看出，測序結(jié)果可以覆蓋樣品中所有能檢測到的序列(>97%).樣品中細菌和古菌的群落多樣性通過群落生態(tài)學中的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannoneven指數(shù)來反映.Chao1指數(shù)用于反映樣品中物種的豐富度.Shannon指數(shù)則可代表生物多樣性，Shannon指數(shù)越大，生物多樣性越高.Shannoneven指數(shù)表示物種個體數(shù)目在群落中分配的均勻程度指數(shù)，其數(shù)值越大不同物種個體的分布越均勻.TB樣品中無論細菌還是古菌的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannoneven指數(shù)均大于TW，表明TB的生物多樣性高于TW，且TB的物種個體分布均勻性也高于TW.

表2 BAC及其原水中微生物多樣性Table 2 Microbial diversity of biological activated carbon and filtered water

TB與TW雖然來自同一活性炭濾池，但其細菌共有OTU數(shù)目僅為67，古菌共有OTU數(shù)目僅為5，遠遠小于它們各自擁有的OTU數(shù)目.從圖2可以看出活性炭與水中微生物種類相差較大.

2.2.2 BAC和濾池水樣中微生物群落結(jié)構(gòu)對比 從圖3可以看出，TW樣品細菌中苯基桿菌屬(Phenylobacterium)占比最大(31.67%)，代爾夫特菌屬(Delftia)占比(12.71%)次之.TW樣品中古菌以甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)和甲烷絲菌屬(Methanothrix)為主，分別占整個古菌群落的60.73%和39.12%.TB樣品的細菌中除未分類的細菌(unclassified_Bacteria)和未分類的浮霉菌科(unclassified_Planctomycetaceae)外，只有Aquicella和Parcubacteria_genera_incertae_sedis占比超過10%，分別為19.05%和11.15%；TB樣品中古菌除未分類的熱原體綱(unclassified_Thermoplasmata)外，氨氧化古菌Nitrosopumilus和Nitrososphaera分別占整個古菌群落的54.20%和9.45%.

此外，基于FAPROTAX數(shù)據(jù)庫的預測結(jié)果(圖4)也表明TW樣品中細菌沒有硝化作用，古菌的硝化作用僅占0.016%.而TB樣品中細菌群落的功能注釋預測硝化作用僅占0.046%，但其古菌群落的硝化作用卻占77.72%，表明BAC的硝化功能是以古菌為主.

A為細菌的OTU;B為古菌的OTU.圖2 TW和TB中微生物OTU的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of OTU distribution of microorganisms in biological activated carbon and filtered water

圖3 TW和TB中細菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)組成Fig.3 Bacterial and archaeal community structure in biological activated carbon and filtered water

2.2.3 氨氧化微生物(AOA和AOB)的群落結(jié)構(gòu) 運用Q-PCR技術(shù)對BAC上AOA和AOB的amoA基因進行定量分析，結(jié)果表明AOA數(shù)量為(49.10±4.45)×105個·g-1(干重)，AOB數(shù)量為(23.20±2.55)×104個·g-1(干重)， AOA數(shù)量顯著大于AOB(P<0.01).

運用T-RFLP技術(shù)對水中和BAC上的AOA和AOB的amoA基因多樣性進行分析，指紋圖譜如圖5所示.圖5中不同峰代表不同種氨氧化微生物.從圖5可以看出，AOA共得到4種氨氧化古菌，A-OTU1、A-OTU2、A-OTU3、A-OTU4的片段長度分別為58、87、95、219，其中BAC上有A-OTU1、A-OTU2和A-OTU3，以A-OUT3為優(yōu)勢種.水中主要有A-OTU3和A-OTU4，以A-OTU4為主.AOB共得到7種不同氨氧化細菌，即B-OTU1、B-OTU2、B-OTU3、B-OTU4、B-OTU5、B-OTU6、B-OTU7，其片段長度分別為65、73、79、87、119、155、216，其中BAC上是以B-OTU1和B-OTU2為主.而水中則同時檢出7種氨氧化細菌，以B-OTU1、B-OTU3和B-OTU4為主，表明AOB在水中的多樣性高于BAC.

圖4 TW和TB的功能預測熱圖 Fig.4 Heat map of function prediction of biological activated carbon and filtered water

A為TB的古菌amoA基因圖譜，B為TB的細菌amoA基因圖譜，C為TW的古菌amoA基因圖譜，D為TW的細菌amoA基因圖譜.圖5 TB和TW的T-RFLP圖譜Fig.5 T-RFLP map of biological activated carbon and filtered water

3 討論與小結(jié)

本研究從BAC的硝化潛勢入手，結(jié)合總體微生物群落結(jié)構(gòu)和氨氧化微生物的豐度以及多樣性，探究了BAC上微生物的主要特征、硝化功能微生物在總體微生物群落所占比例，以及兩大類不同氨氧化微生物之間的關(guān)系.此外，通過將BAC和濾池水樣進行對比，探討了BAC上微生物形成的原因及可能的來源.

從BAC硝化潛勢結(jié)果可以看出，溶液中沒有檢測到亞硝態(tài)氮的存在，表明亞硝態(tài)氮在培養(yǎng)試驗中能夠很快被氧化成硝態(tài)氮.此外，溶液中存在總氮化學不平衡的現(xiàn)象，推測產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是BAC在水廠的長期運行過程中已吸附了處理水中一定量的硝態(tài)氮，吸附的硝態(tài)氮隨著培養(yǎng)時間而逐漸釋放.BAC的硝化潛勢為 0.013 8 mg·L-1·h-1·g-1(干重)，與Niu et al[16]報道的日本水廠BAC在冬季硝化潛勢值[0.019 mg·L-1·h-1·g-1(干重)]相當，但低于夏季的硝化潛勢[0.027～0.037 mg·L-1·h-1·g-1(干重)].本研究采樣時間與文獻[16]中報道的冬季采樣時間一致，表明采樣時間有可能影響對BAC硝化能力的評價.

通過高通量測序發(fā)現(xiàn)BAC和濾池水中的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，且BAC的群落多樣性和個體均勻程度均高于水體，這可能是由于活性炭較大的比表面積及其表面的一些大孔使微生物有效地定植生長且不受水流作用而脫落[13].同時，由于活性炭對水中的營養(yǎng)成分有較高的吸附能力[17]，且對氧的親和力較高[18]，為微生物的富集生長提供了可能.對屬水平的微生物群落組成的研究發(fā)現(xiàn)濾池水中甲烷古菌占主導地位.活性炭的種群結(jié)構(gòu)及功能預測則顯示氨氧化古菌在BAC上起著至關(guān)重要的作用，表明活性炭上的微生物群落結(jié)構(gòu)不受處理水中的微生物組成影響.

為進一步探討氨氧化機制，運用Q-PCR和T-RFLP方法對BAC上兩種類型的氨氧化微生物AOA和AOB進行數(shù)量和多樣性比較，發(fā)現(xiàn)BAC上AOA的數(shù)量多于AOB，且與東京水廠的冬季BAC上的AOA數(shù)量[(1.8×105～1.5×109)個·g-1)]相當.但AOB數(shù)量則略低于東京水廠的冬季BAC上的AOB數(shù)量[(4.5×105～4.1×107)個·g-1(干重)][16].AOA在活性炭上處于主導地位，這與AOA對環(huán)境因子的適應(yīng)性比AOB高有關(guān)[19].酸堿度是AOB的限制性因子，但AOA卻能適應(yīng)環(huán)境中更廣范圍的pH值.又如Klotz et al[20]發(fā)現(xiàn)AOA對溫度的適應(yīng)范圍比AOB大，其對溫度的耐受性也更好.此外對比水中和BAC上氨氧化微生物的T-RFLP圖譜，發(fā)現(xiàn)無論是AOA還是AOB，其在BAC和水中的群落結(jié)構(gòu)并不一致，表明氨氧化微生物在BAC上的定植、富集是具有選擇性的.同時也說明BAC上微生物種類及數(shù)量并不受處理水的影響.從T-RFLP得到的氨氧化微生物片段長度可以看出本研究的OTU片段長度與國外已報道的BAC上的OTU長度不一致[7,21]，說明BAC上所存在的氨氧化微生物種類與國外水廠不同.國內(nèi)外飲用水廠中BAC上氨氧化微生物的差異與BAC所處理的水源水質(zhì)、運行條件、材質(zhì)、粒徑等有關(guān).

本研究得到如下結(jié)果：(1)BAC的硝化潛勢測定結(jié)果表明其硝化能力與已報道的BAC的硝化能力相當，但采樣時間可能是影響硝化潛勢差異的主要原因；(2)BAC和濾池水中的總體微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，且氨氧化微生物(AOA和AOB)在BAC上和水中的群落組成也不一樣，表明微生物在BAC上的定植具有選擇性；(3)BAC上氨氧化古菌和氨氧化細菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果都表明AOA在BAC上占主導地位.