彭星華，王芳，史帥，秦曉輝，霍艷兵

（河北省邯鄲市第一醫(yī)院 1.普外一科 2.麻醉科，河北 邯鄲 056000）

三陰性乳腺癌（triple-negativebreast cancer,TNBC）占乳腺癌的 15%～20%，是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2均為陰性的乳腺癌[1]。研究[2-3]表明，TNBC較其他類(lèi)型乳腺癌更易發(fā)生在年輕絕經(jīng)前女性中，其5年生存率明顯低于非三陰性乳腺癌患者且具有更早出現(xiàn)耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移率高、復(fù)發(fā)率高及預(yù)后差的特點(diǎn)。

核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白karyopherin α2（nuclear transporter karyophenin 2，KPNA2）屬于核運(yùn)輸信號(hào)超家族，是協(xié)助轉(zhuǎn)錄因子、mRNA、DNA和RNA聚合酶等進(jìn)出細(xì)胞核的重要運(yùn)載工具，因而在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、發(fā)育、遷移及DNA應(yīng)答和損傷修復(fù)過(guò)程可發(fā)揮重要作用，但關(guān)于三陰乳腺癌的相關(guān)研究資料較少[4-5]。本研究探討KPNA2在三陰性乳腺癌患者中的表達(dá)特點(diǎn)及與患者遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床三陰乳腺癌的治療靶點(diǎn)和預(yù)后提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2020年2月我院保存的三陰性乳腺癌標(biāo)本60 例以及非三陰性乳腺癌標(biāo)本59例，同時(shí)選取正常乳腺組織50例作為對(duì)照（距離腫瘤邊緣≥5 cm），納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴均經(jīng)病理學(xué)確診；⑵研究前未行放化療等治療；⑶女性患者；⑷臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤；⑵合并有內(nèi)分泌疾病等其他嚴(yán)重疾病。各組織患者一般資料比較見(jiàn)表1。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

表1 各組一般資料比較

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組化染色法檢測(cè)KPNA2表達(dá)：取適量乳腺組織，將中性福爾馬林固定脫水后的石蠟包埋組織連續(xù)切取厚度為3～4 μm的病理切片，晾干后置于75°C烤臺(tái)，烘烤20 min，依次經(jīng)二甲苯脫蠟20 min、無(wú)水乙醇X2、95%乙醇X2、85%乙醇X2處理，去離子水清洗后利用檸檬酸高壓修復(fù)抗原過(guò)氧化氫（3%）阻斷內(nèi)源化過(guò)氧化物酶活性，KPNA2蛋白一抗加入后反應(yīng)過(guò)夜（4℃），二抗30 min孵育（37℃），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，PBS代替一抗為陰性對(duì)照并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照。采用雙盲法由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床病理專(zhuān)家分別進(jìn)行單獨(dú)判斷，KP-NA2指標(biāo)每張切片共觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的占比情況，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；＞20%為陽(yáng)性[6]（圖1）。

圖1 免疫組化染色圖（×400） A：三陰性乳腺癌組織KPNA2 陽(yáng)性表達(dá)；B：非三陰性乳腺癌組織KPNA2 陽(yáng)性表達(dá)；C：正常乳腺組織KPNA2 陰性表達(dá)

1.3 隨訪方式

所有三陰性乳腺癌患者采用電話隨訪和門(mén)診復(fù)診的方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為3～59個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0 軟件，年齡、體質(zhì)量指數(shù)等數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表達(dá)，KPNA2陽(yáng)性表達(dá)率等數(shù)據(jù)采用頻數(shù)（百分比）形式表達(dá)，t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)分析組間差異；預(yù)后曲線采用Kaplan-Meier法描繪，采用Log-rand比較差異；預(yù)后多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組織KPNA2 表達(dá)比較

三陰性乳腺癌組織KPNA陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織（χ2=23.489，P=0.000<0.05）;與非三陰性乳腺癌組織比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.416，P=0.519＞0.05）（表2）。

表2 各組織KPNA2 表達(dá)比較[n（%）]

2.2 KPNA2 表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征關(guān)系

在三陰性乳腺癌組織中，中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織KPNA2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織（P<0.05）（表3）。

表3 KPNA2表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征關(guān)系[n（%）]

2.3 KPNA2 表達(dá)與非三陰性乳腺癌臨床病理特征關(guān)系

不同非三陰性乳腺癌組織中KPNA2陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表4）。

表4 KPNA2表達(dá)與非三陰性乳腺癌臨床病理特征關(guān)系[n（%）]

2.4 KPNA2 表達(dá)與三陰性乳腺癌患者CA125、CEA 關(guān)系

KPNA2陽(yáng)性和陰性表達(dá)的三陰性乳腺癌患者血清CA125、CEA比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表5）。

表5 KPNA2 表達(dá)與三陰性乳腺癌患者CA125、CEA 關(guān)系(±s)

表5 KPNA2 表達(dá)與三陰性乳腺癌患者CA125、CEA 關(guān)系(±s)

KPNA2 表達(dá)nCA125（U/mL）CEA（ng/mL）陽(yáng)性4176.29±24.4932.20±11.12陰性1971.02±30.2235.50±15.50 t 0.719 -0.941 P 0.4750.351

2.5 三陰性乳腺癌組織KPNA2 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

在三陰性乳腺癌患者中，KPNA2陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存總時(shí)間為23 個(gè)月（95%CI：29.29～32.71），明顯短于KPNA2陰性表達(dá)患者31.00個(gè)月（95%CI：29.29～32.71），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.386，P=0.020<0.05）（圖1）。

圖1 KPNA2 陽(yáng)性及陰性表達(dá)者生存曲線圖

2.6 三陰性乳腺癌預(yù)后多因素分析

將患者年齡、腫瘤大小、脈管內(nèi)癌栓、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及KPNA2作為自變量進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示：TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及KPNA2表達(dá)是預(yù)后的影響因素（RR=1.863、1.650、1.706和1.508，P<0.05）（表6）。

表6 三陰性乳腺癌預(yù)后多因素分析

3 討論

臨床上將HER-2、ER及PR均表達(dá)陰性的乳腺癌歸為三陰乳腺癌，與常規(guī)的乳腺癌相比，其具有侵襲能力器及預(yù)后較差等特點(diǎn)，患者治療后極易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)，以肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移較為多見(jiàn)，而腦轉(zhuǎn)移是屬于三陰乳腺癌的特征性轉(zhuǎn)移部位[7-9]?，F(xiàn)階段臨床對(duì)三陰乳腺癌患者采取的常規(guī)乳腺癌的蒽環(huán)類(lèi)化療方法療效不佳，且靶向治療和生物內(nèi)分泌治療也基本無(wú)效，這也是導(dǎo)致三陰乳腺癌的臨床預(yù)后較差的主要原因[10-12]。

KPNA2一種參與細(xì)胞增殖凋亡、分化、免疫反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及病毒感染等多種生命活動(dòng)的核內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍譡13-14]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)KPNA2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)蛋白核轉(zhuǎn)位參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌組織KPNA陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織。上述結(jié)果提示三陰性乳腺癌患者存在KPNA2的異常表達(dá)。為保證細(xì)胞能夠準(zhǔn)確開(kāi)展各項(xiàng)功能工作，決定細(xì)胞命運(yùn)和功能的轉(zhuǎn)錄因子和mRNA等大分子物質(zhì)空間定位均需要得到精細(xì)調(diào)控。而KPNA2作為重要的和運(yùn)輸?shù)鞍啄軌蛲ㄟ^(guò)識(shí)別大分子的核定位信號(hào)，參與乳腺癌細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程[17]。

結(jié)果顯示，在三陰性乳腺癌組織中，中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織KPNA2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織。該結(jié)果說(shuō)明KPNA2參與了三陰乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。相關(guān)研究[18]提示KPNA2可參與c-myc、E2F1等多種腫瘤相關(guān)因子的核轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)程而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和惡性增殖；另外，KPNA2還可能通過(guò)定位和運(yùn)輸p53的胞漿促進(jìn)細(xì)胞增殖基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的惡性增殖和侵襲。

大量研究[19-20]提示胃癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤均發(fā)現(xiàn)KPNA2的過(guò)度表達(dá)，并證實(shí)過(guò)度表達(dá)的KPNA2可能與腫瘤的不良預(yù)后存在相關(guān)性，可以作為一種患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)，指導(dǎo)治療方案得到選擇。有研究[21]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌基因高表達(dá)可能與高Ki-67指數(shù)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)化等有關(guān)。進(jìn)一步預(yù)后分析結(jié)果顯示三陰性乳腺癌患者中KPNA2陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存總時(shí)間較KPNA2陰性表達(dá)患者明顯縮短。導(dǎo)致上述結(jié)果的可能因?yàn)镵PNA2具有介導(dǎo)RAC-1等多種轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位過(guò)程的能力，而RAC-1可參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期及遷移功能進(jìn)而腫瘤的發(fā)展過(guò)程并影響患者預(yù)后。

多因素分析結(jié)果顯示TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及KPNA2表達(dá)是三陰性乳腺癌患者預(yù)后的影響因素。故而，三陰乳腺癌患者需要特別注意分期、淋巴轉(zhuǎn)移及KPNA2表達(dá)，改善患者的預(yù)后。文獻(xiàn)[22]提示人乳腺癌病灶組織較癌旁正常組織KPNA2表達(dá)上調(diào)30%作用且KPNA2表達(dá)水平與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)正相關(guān)，與患者生存率負(fù)相關(guān)；也有國(guó)外研究[18]提示良性乳腺細(xì)胞株過(guò)表達(dá)KPNA2能夠可誘導(dǎo)多種惡性細(xì)胞增殖分化，但siRNA沉默KPNA2可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。

本研究的創(chuàng)新在于較系統(tǒng)地對(duì)三陰性乳腺癌患者KPNA2表達(dá)進(jìn)行了分析，并證實(shí)了其與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，且與患者預(yù)后有關(guān)，可以為臨床三陰乳腺癌的治療和預(yù)后提供數(shù)據(jù)參考。