王子偉 張園園 劉濤 王偉

摘 要：以枸骨葉多糖為試驗(yàn)材料，通過單因素試驗(yàn)測(cè)定枸骨葉多糖的得率，研究液料比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素對(duì)枸骨葉多糖的影響;在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法分析優(yōu)化提取條件。結(jié)果表明，枸骨葉多糖提取的最佳工藝條件為：液料比31∶1，提取時(shí)間1.5h，提取溫度82.3℃，在此條件下，枸骨葉多糖得率為6.96%。該工藝條件組合較好，可用于枸骨葉多糖的提取，并為今后枸骨葉多糖的進(jìn)一步研究具有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：枸骨葉;多糖得率;提取工藝;響應(yīng)面分析法

中圖分類號(hào) TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）11-0133-04

Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Holly Leaves by Response Surface Analysis

WANG Ziwei et al.

（College of Food Science， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang 464000， China）

Abstract： The extraction process of polysaccharide from holly leaves was optimized by single factor test and response surface analysis. The effect of liquid-material ratio， extraction time and extraction temperature on the green of was studied. On the basis of single factor test， the extraction conditions are optimized by response surface method. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： liquid ratio 31∶1， extraction time 1.5h， extraction temperature 82.3℃. Under this condition， the yield of polysaccharide was 6.96. It can be used for polysaccharide from holly leaves. It has important reference value for the further study of polysaccharides from holly leaves.

Key words： Holly leaf; Polysaccharide yield; Extraction technology; Response surface analysis

枸骨葉即枸骨的干燥葉，枸骨屬冬青科植物，別名羊角刺、鳥不宿，主要產(chǎn)自于河南、安徽、江蘇、浙江、湖北以及其他長(zhǎng)江中下游等地。枸骨葉始載于《本草拾遺》，傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為，枸骨葉具有清熱養(yǎng)陰、平肝益腎以及散風(fēng)通絡(luò)等功效[1]。另外，它還可用于肺癆咯血、頭暈?zāi)垦！⒏哐獕旱劝Y狀的緩解[1]。枸骨葉中含有萜類化合物及有機(jī)酸、多糖類（苷類）多種生物活性物質(zhì)，具有很好的研究?jī)r(jià)值[2-3]。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，植物多糖具有優(yōu)良的抗自由基功能，不僅可以抗氧化[4]、抗腫瘤[5-6]、抗衰老、降血脂和膽固醇[7-8]，也是很好的免疫增強(qiáng)劑，具有抗癌作用[9]。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)枸骨葉化學(xué)成分及功效進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道仍較少，尤其是對(duì)枸骨葉多糖的研究尚未見報(bào)道。因此，為進(jìn)一步開發(fā)利用枸骨資源，本研究以枸骨葉為原料，利用響應(yīng)面法對(duì)枸骨葉多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為開發(fā)枸骨葉多糖提供依據(jù)，也為今后的研究及其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 枸骨葉（宇航中藥材種植有限公司，產(chǎn)地，河南）。試劑：苯酚（濟(jì)南創(chuàng)世化工有限公司，分析純），濃硫酸（湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司，分析純），葡萄糖（無錫市晶科化工有限公司，分析純），無水乙醇，丙酮，乙醚等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 紫外分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限公司），高速藥物粉碎機(jī)（WK-4008，青州市（山東）精誠機(jī)械有限公司），離心機(jī)（LDZ4-0.8，北京醫(yī)用離心機(jī)廠），數(shù)顯提取恒溫鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枸骨葉粗多糖的提取工藝 工藝流程：枸骨葉粉末→熱水浸提→離心取上清液→減壓濃縮→加4倍無水乙醇→丙酮、乙醚洗滌沉淀→真空干燥得枸骨葉粗多糖。稱取2.0000g枸骨葉粉末，置于250mL錐形瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，置于恒溫水浴箱中加熱浸提，再將恒溫加熱過的料液用紗布過濾，并洗滌濾渣多次，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至1/4體積，隨后加入體積為濃縮液體積4倍的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，靜置過夜。將樣品于3000r轉(zhuǎn)速下離心分離10min左右，即得到枸骨葉粗多糖。

1.3.2 多糖的測(cè)定 多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[10]。枸骨葉多糖提取得率計(jì)算公式如下：

多糖提取率（%）=[提取液濃?。╱g/mL）×提取液稀釋取液×提取液體積（mL）原料干重（g）×1000000]×100

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取在105℃下經(jīng)干燥至恒重的葡萄糖2.5000g于50mL干凈的燒杯中并定容于500ml的容量瓶中。然后移取2mL，定容于100mL容量瓶中，即得濃度為100ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL具塞試管中，加水至2mL，搖勻，加入1mL體積分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液，搖勻，加入5mL濃硫酸，立即振蕩搖勻，靜置30min。在490nm處測(cè)定其吸光度。作濃度-吸光度曲線，如圖1所示。得其線性回歸方程為：Y=0.011X+0.017（R2=0.9962）。

1.3.4 枸骨葉多糖提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 最適料液比的確定 稱取5份2.0000g粉碎后的枸骨粉，固定提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1.5h，設(shè)置液料比梯度分別為25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1，加入70mL的蒸餾水，置于恒溫水浴鍋中進(jìn)行粗提取。提取完成后過濾、離心3000r、10min），得上清液，測(cè)定吸光度。

1.3.4.2 最適提取時(shí)間的確定 稱取5份2.0000g枸骨葉粉，固定液料比為35∶1和提取溫度為80℃，提取時(shí)間依次設(shè)定為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，然后置于恒溫水浴箱中進(jìn)行提取。收集濾液、離心（3000r、10min），得上清液，測(cè)定吸光度。

1.3.4.2 最適提取溫度的確定 稱取5份2.0000g枸骨葉粉，固定液料比為35∶1和提取時(shí)間為90min，提取溫度依次設(shè)定為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，然后置于恒溫水浴箱中進(jìn)行提取。收集濾液、離心（3000r、10min），得上清液，測(cè)定吸光度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Benhnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。以枸骨葉多糖提取得率為響應(yīng)值，并將料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）作為自變量，優(yōu)化其提取工藝。自變量的試驗(yàn)水平用-1、0、1作為編碼，共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)作為分析點(diǎn)，5個(gè)作為區(qū)域的中心零點(diǎn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差[11-14]，通過建立多元二次回歸模型方程，用多項(xiàng)式對(duì)本實(shí)驗(yàn)中各個(gè)因素與指標(biāo)的相互關(guān)系進(jìn)行近似擬合，通過對(duì)回歸方程的分析及各因素交互作用的響應(yīng)面圖形分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸骨葉多糖提取工藝參數(shù)

2.1.1 液料比對(duì)枸骨葉多糖提取得率的影響 由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，枸骨葉多糖提取得率隨料液比的增加而不斷增加，當(dāng)液料比較小時(shí)，由于樣品中的多糖未能充分溶解，故多糖提取得率隨著液料比的增大而升高，枸骨葉多糖的提取得率在液料比35∶1時(shí)達(dá)到最高，然而當(dāng)液料比超出35∶1后，多糖提取得率趨于平緩，不再有明顯的下降趨勢(shì)。因此，考慮到后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作，選取35∶1為最佳液料比。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)枸骨葉多糖提取得率的影響 如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間為1.5h時(shí)，枸骨葉多糖提取得率達(dá)到最大;提取時(shí)間小于1.5h時(shí)，在設(shè)定范圍內(nèi)多糖提取得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而提高。超出1.5h以后，多糖提取得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。其可能的原因是隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致多糖分解。因此，多糖提取的最佳水浴時(shí)間為1.5h。

2.1.3 提取溫度對(duì)枸骨葉多糖提取得率的影響 如圖4所示，在設(shè)定范圍內(nèi)，多糖提取得率的變化趨勢(shì)隨著提取溫度的升高表現(xiàn)為先上升后有所下降且逐漸趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，提取率最高;高于80℃時(shí)，由于多糖可能會(huì)部分分解，故多糖提取得率緩慢下降。因此，最佳的多糖提取溫度設(shè)為80℃。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨葉多糖提取工藝

2.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)枸骨葉多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，響應(yīng)面分析見表2，方差分析見表3。通過對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得到枸骨葉多糖提取率的回歸方程為：Y=6.62-0.52A+0.076B+0.54C-0.027AB-0.080AC+0.060BC-0.28A2-0.80B2-0.72C2。通過對(duì)方程的進(jìn)一步分析可以確定優(yōu)化枸骨葉多糖提取的最佳工藝參數(shù)組合。

2.2.2 回歸模型的方差分析 從表3可以看出，模型P<0.0001<0.01，方程回歸極顯著;同時(shí)，該回歸方程相關(guān)系數(shù)平方R2=0.9866，又因?yàn)樵撃Ｐ偷氖M項(xiàng)P為0.0736>0.05，說明模型擬合度高，可用來描述枸骨葉多糖提取率與其影響因素之間的關(guān)系。經(jīng)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)方法可靠。另外，從對(duì)數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果可以看出，模型中一次項(xiàng)A、C、二次項(xiàng)A2、B2、C2的P<0.0001，說明差異極顯著，一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB、AC、BC差異不顯著（P>0.05）。此結(jié)果表明，枸骨葉多糖提取得率總體上受單因素影響較其受單因素之間的交互作用影響更顯著。

根據(jù)回歸方程，利用Design-Expert8.0.6軟件繪制響應(yīng)面3D圖，可以直觀地反映出兩兩因素交互作用的響應(yīng)情況。由圖5可知，提取時(shí)間與液料比對(duì)枸骨葉多糖提取率的影響呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，即隨其各自值的變大而先增加后減小，但由曲面陡峭程度相比較而言，提取時(shí)間比液料比對(duì)多糖提取率影響更大。另外，由圖5可知，在液料比35∶1時(shí)提取1.5h左右，其多糖提取率最佳。

由圖6可知，液料比與提取溫度所構(gòu)成的響應(yīng)面圖形有最高點(diǎn)，即存在兩者的最佳組合，但液料比的曲線彎曲程度不如提取溫度的曲線彎曲程度大，這表明提取溫度比液料比對(duì)多糖提取率影響更顯著。由圖6也可看出，在提取溫度達(dá)到85℃，液料比35∶1時(shí)，最適宜進(jìn)行多糖提取。

由圖7可知，提取時(shí)間與提取溫度所構(gòu)成的響應(yīng)面圖形有最高點(diǎn)，即其最佳組合;且提取時(shí)間與提取溫度對(duì)多糖提取率的影響呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。同時(shí)，由曲面陡峭程度相比較而言，兩者也十分接近，但提取溫度比提取時(shí)間略微陡峭一點(diǎn)，故提取溫度相比提取時(shí)間而言對(duì)多糖提取率影響略大一點(diǎn)。另外，從圖7還可以看出，當(dāng)液料比一定，在提取溫度85℃下提取1.5h時(shí)，枸骨葉多糖的提取率達(dá)到最大值。

2.2.3 最佳工藝條件的確定 利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行優(yōu)化，枸骨葉多糖提取的最佳工藝為：液料比31.08∶1，提取時(shí)間1.51h，提取溫度82.29℃，此時(shí)理論上枸骨葉多糖提取率達(dá)到最佳，達(dá)到6.96%。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，依據(jù)最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，得出枸骨葉多糖提取率平均值為6.82%，與上述預(yù)測(cè)值6.96%相對(duì)誤差較小。

4 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定枸骨葉多糖提取得率的最佳工藝條件為：液料比31.08∶1，提取時(shí)間1.51h，提取溫度82.29℃?？紤]到實(shí)際操作的便利性，為了最大程度地提高枸骨葉的多糖提取率，有效開發(fā)和利用枸骨葉中的多糖成分，在實(shí)際操作中可以將條件設(shè)定為：液料比30∶1，提取時(shí)間1.5h，提取溫度83℃。同時(shí)，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)多糖提取率為6.82%，與理論最佳值6.96%的相對(duì)誤差較小。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨葉多糖提取的工藝參數(shù)可靠有效，不僅可以作為實(shí)際應(yīng)用操作的參考，也為進(jìn)一步研究枸骨葉多糖提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)編：張宏民）