王錦祥，孫世坤，陳巖峰，陳冬金，桑 雷，謝喜平

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染兔引起的一種傳染病。該病一年四季均可發(fā)生，且所有日齡的兔均可發(fā)病。臨床上，兔巴氏桿菌病以呼吸道癥狀多見，也可見中耳炎和結(jié)膜炎[1?2]。該病是兔的常發(fā)病和多發(fā)病，是危害兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疾病。根據(jù)多殺性巴氏桿菌的莢膜抗原可將其分為5種血清型，即A、B、D、E和F型[3]。其中，A和D型菌株是兔群中的優(yōu)勢流行菌株[4?5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】F型多殺性巴氏桿菌最早在美國的火雞中發(fā)現(xiàn)[6]，該菌株主要感染禽類[7]，其感染能引起禽霍亂[8]。然而，研究表明國內(nèi)外兔群中也存在F型多殺性巴氏桿菌，且該菌株對兔具有強(qiáng)致病性[9?11]。由此可見，兔群中F型多殺性巴氏桿菌的出現(xiàn)，使兔巴氏桿菌病的病因更加復(fù)雜，也使該病的確診更加困難。因此，實(shí)現(xiàn)對F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測，掌握其在兔群中的流行情況，對兔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。【本研究切入點(diǎn)】目前，用于F型多殺性巴氏桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有細(xì)菌分離鑒定和多重PCR[3,10]。多殺性巴氏桿菌營養(yǎng)需求高、生長較緩慢，容易受其他生長較快的細(xì)菌污染。多重PCR用于多殺性巴氏桿菌的莢膜分型[3]，反應(yīng)體系中包含6對引物，對反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件都要求很高，否則會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增或假陰性結(jié)果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了建立一種快速且簡便的F型多殺性巴氏桿菌檢測方法，本研究根據(jù)多殺性巴氏桿菌kmt1基因和F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的保守序列分別設(shè)計(jì)了2對特異性引物，建立了檢測F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR檢測方法，為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 2×PCR Mix、pEASY-T1克隆載體、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購自 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 菌株 兔源A、D和F型多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumonia）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中公布的多殺性巴氏桿菌kmt1基因（登錄號：KX348143）和F型多殺性巴氏桿菌的fcbD基因（登錄號：AF302467），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了2對分別針對kmt1基因和fcbD基因保守序列的特異性引物，kmt1基因引物序列為：kmt1-F：5′-gttttatgccacttgaaatgggaa-3′/kmt1-R：5′-taagaaacgtaactcaacatggaaatatt-3′；fcbD基因引物序列為：fcbD-F：5′-ctaaagatcttgttcttgctccattg-3′/fcbD-R：5′-tctgcggtaatattatgagtatccac-3′，擴(kuò)增的目的片段分別為260 bp和490 bp。引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 單重PCR方法的建立及擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 以提取的兔源F型多殺性巴氏桿菌基因組DNA為模板，分別利用kmt1基因和fcbD基因引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。單重PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 25 μL，基因組DNA 1 μL，上下游引物（10 μmol·L?1）各2 μL，滅菌ddH2O 20 μL，共50 μL反應(yīng)體系。單重PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化后克隆至pEASY-T1克隆載體，送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 雙重PCR方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 將kmt1基因和fcbD基因引物調(diào)整至40 μmol·L?1，等體積混勻后作為雙重PCR的引物。雙重PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 25 μL，兔源F型多殺性巴氏桿菌基因組DNA 1 μL，混合引物4 μL，滅菌ddH2O 20 μL，共50 μL反應(yīng)體系。雙重PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 90 s、72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。在此基礎(chǔ)上，設(shè)置雙重PCR方法的退火溫度在54～60 ℃、混合引物終濃度在0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol·L?1進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的退火溫度和引物濃度。

1.2.4 雙重PCR方法的特異性試驗(yàn) 分別以提取的兔源A、D和F型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，應(yīng)用建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測，設(shè)置陰性對照（滅菌ddH2O），評估該雙重PCR方法的特異性。

1.2.5 雙重PCR方法的敏感性試驗(yàn) 將莢膜F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA 10倍倍比稀釋，使雙重PCR反應(yīng)體系中DNA模板的含量為1×107～1×100拷貝·μL?1，設(shè)置陰性對照（滅菌ddH2O），評估該方法的敏感性。

1.2.6 雙重PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn) 取90份已知結(jié)果的病死兔肺臟樣品，平均分為3組，每組30份（A型多殺性巴氏桿菌樣品5份，D型多殺性巴氏桿菌5份，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌5份，支氣管敗血波氏桿菌3份，肺炎克雷伯菌3份，大腸桿菌3份，金黃色葡萄球菌3份，陰性樣品3份）。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取樣品的基因組DNA，平均分為3份，利用建立的雙重PCR方法分3次檢測（每次檢測90份），每次檢測時(shí)每份樣品重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)批內(nèi)和批間變異系數(shù)，評估該雙重PCR方法的重復(fù)性。

1.2.7 雙重PCR方法的初步應(yīng)用 選取從龍巖、三明、南平、福州和寧德5個(gè)地區(qū)收集的87份已知結(jié)果的呼吸道病死兔肺臟樣品，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR方法和已報(bào)道的多重PCR方法[3]同時(shí)對87份臨床樣品進(jìn)行檢測。統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果，比較兩種PCR方法檢測結(jié)果與已知結(jié)果的一致性以及兩種PCR方法檢測結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR方法的建立及擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的kmt1基因和fcbD基因引物分別進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為260 bp和490 bp（圖1），與預(yù)期目的片段大小相符。將上述2條目的片段克隆至pEASY-T1克隆載體并測序，測序結(jié)果顯示2條目的片段序列與相應(yīng)參考基因的序列同源性均為100%。

圖1 單重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Detection by single PCR amplification

2.2 雙重PCR方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

以兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA為模板，應(yīng)用kmt1基因和fcbD基因引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在同一反應(yīng)體系中，2對引物均能特異地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的目的片段（圖2）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對雙重PCR的退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)退火溫度為54～60 ℃時(shí)，該雙重PCR的擴(kuò)增效果均較好（圖3）；當(dāng)混合引物濃度為0.8 μmol·L?1時(shí)（圖4），雙重PCR擴(kuò)增效果最好。退火溫度高，則特異性強(qiáng)。因此，確定該雙重PCR的最佳反應(yīng)條件為退火溫度60 ℃，混合引物濃度0.8 μmol·L?1。

注：M:DNA Marker; 1:kmt1和fcbD基因; 2:陰性對照 。Note: M: DNA marker; 1: kmt1 and fcbD genes; 2: negative control.

圖3 雙重PCR方法反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig. 3 Optimization on reaction temperature for duplex PCR assay

圖4 雙重PCR檢測方法引物濃度優(yōu)化Fig. 4 Optimization on primer concentration for duplex PCR assay

2.3 雙重PCR方法的特異性

利用建立的雙重PCR能同時(shí)特異地?cái)U(kuò)增出兔源F型多殺性巴氏桿菌的kmt1基因片段和fcbD基因片段，能擴(kuò)增出兔源A型和D型多殺性巴氏桿菌的kmt1基因片段，對兔源支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和陰性對照（滅菌ddH2O）則為陰性（圖5）。結(jié)果表明，該雙重PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖5 雙重PCR檢測方法特異性試驗(yàn)Fig. 5 Specificity of duplex PCR assay

2.4 雙重PCR方法的敏感性

將兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA 10倍倍比稀釋（1×107～1×100拷貝·μL?1）。結(jié)果顯示，該雙重PCR的最低檢測限為1×103拷貝·μL?1基因組 DNA（圖6），表明該雙重PCR具有良好的敏感性。

圖6 雙重PCR檢測方法敏感性試驗(yàn)Fig. 6 Sensitivity of duplex PCR assay

2.5 雙重PCR方法的重復(fù)性

應(yīng)用建立的雙重PCR對90份已知結(jié)果的病死兔肺臟樣品（3組，每組30份）分3批次進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)和批間結(jié)果均一致，表明該雙重PCR具有良好的重復(fù) 性。

2.6 雙重PCR方法的初步應(yīng)用

>應(yīng)用建立的雙重PCR方法和已報(bào)道的多重PCR方法同時(shí)對87份已知結(jié)果（A型多殺性巴氏桿菌陽性樣品30份，D型多殺性巴氏桿菌陽性樣品應(yīng)用建立的雙重PCR方法和已報(bào)道的多重PCR方法同時(shí)對87份已知結(jié)果（A型多殺性巴氏桿菌陽性樣品30份，D型多殺性巴氏桿菌陽性樣品9份，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌陽性樣品8份，支氣管敗血波氏桿菌陽性樣品11份，肺炎克雷伯菌陽性樣品2份，大腸桿菌陽性樣品1份，金黃色葡萄球菌陽性樣品3份，陰性樣品23份）的呼吸道病死兔肺臟樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，雙重PCR檢測出多殺性巴氏桿菌陽性樣品49份（其中F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品8份），陰性樣品38份。多重PCR檢測出多殺性巴氏桿菌陽性樣品43份（其中A型多殺性巴氏桿菌陽性樣品30份，D型多殺性陽性樣品7份，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌陽性樣品6份），陰性樣品39份，非特異擴(kuò)增樣品5份。雙重PCR方法檢測結(jié)果和已報(bào)道的多重PCR方法檢測結(jié)果與已知結(jié)果的符合率分別為97.70%和94.25%。雙重PCR方法檢測結(jié)果與已報(bào)道的多重PCR方法檢測結(jié)果的符合率為93.10%。上述結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法準(zhǔn)確性高，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 討論與結(jié)論

多殺性巴氏桿菌感染是引起兔呼吸道疾病的重要病原之一，常常引起致死性感染。臨床上，致死性病例以50～70日齡的商品兔、懷孕后期母兔和哺乳母兔多見，給養(yǎng)兔業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12]。兔巴氏桿菌病主要由A和D型多殺性巴氏桿菌感染引起[4?5]。F型多殺性巴氏桿菌首次分離自火雞[6]，主要在禽類中流行病且致病性強(qiáng)[7?8]。然而，在國內(nèi)外兔群中也發(fā)現(xiàn)有該菌的存在，且其感染能引起兔的嚴(yán)重致死性呼吸道疾病[9?11]。由此可見，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌在兔群中的出現(xiàn)使兔巴氏桿菌病病因更加復(fù)雜，導(dǎo)致該病的確診更加困難。

本試驗(yàn)根據(jù)多殺性巴氏桿菌的kmt1基因和F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的保守序列分別設(shè)計(jì)了2對特異性引物，建立了檢測F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR方法。kmt1基因是多殺性巴氏桿菌的種特異性基因，以該基因?yàn)槟康幕蚰芙z測多殺性巴氏桿菌的特異性PCR檢測方法[13?14]。fcbD基因編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜中的軟骨素，是F型菌株中的特異性基因，以該基因?yàn)槟康幕蚰芙㈣b定F型多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的多重PCR方法[3]。由此可見，以kmt1基因和fcbD基因?yàn)槟康幕蚰芙⑻禺惖臋z測兔源F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR檢測方法。本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法快速簡便，不僅克服了細(xì)菌分離鑒定的費(fèi)時(shí)，還克服了多殺性巴氏桿菌莢膜分型多重PCR方法的費(fèi)力。此外，該雙重PCR方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值，為掌握兔群中F型多殺性巴氏桿菌的流行情況提供了有力的技術(shù)手段。