金匱腎氣丸通過AMPK/mTOR途徑抑制肺組織細(xì)胞凋亡和自噬在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的作用

劉明，謝力，皮淼，王玲

（株洲市中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，株洲 412000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）簡稱慢阻肺，是一種常見的以氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病。COPD由于其高發(fā)病率和高病死率，已成為全球性的公共健康問題。全世界約有6 500萬患者患有中重度COPD[1]。中國最近的1項(xiàng)研究表明，COPD的總患病率為8.6%，40歲以上人群的患病率高達(dá)13.7%[2]。2017年，全世界共有319萬人死于COPD[3]。因此，尋找更為有效的治療藥物刻不容緩。金匱腎氣丸是以中藥附子與桂枝為主藥加入熟地黃等六味中藥材一起制成的中成藥，具有滋陰壯陽的功效[4]。已有研究表明，金匱腎氣丸聯(lián)合玉屏風(fēng)散可改善COPD大鼠肺組織病理學(xué)變化，抑制氣道炎癥[5]，該研究表明，金匱腎氣丸在COPD治療方面具有巨大的潛力，但金匱腎氣丸在COPD中的作用機(jī)制尚不明確。已經(jīng)證實(shí)，自噬水平的升高參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥的調(diào)節(jié)，與細(xì)胞死亡和COPD發(fā)病密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是參與COPD發(fā)病的另一重要生理過程[6]。AMPK/mTOR途徑是介導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡生理過程的重要通路[7]。本研究通過建立COPD大鼠模型，旨在探究金匱腎氣丸對COPD大鼠肺組織細(xì)胞凋亡和自噬的作用及其作用機(jī)制是否與AMPK/mTOR途徑相關(guān)，以期為明確金匱腎氣丸對COPD的作用機(jī)制及開發(fā)新的COPD治療藥物提供新的科學(xué)資料。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用中藥 金匱腎氣丸由熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸 12 g，茯苓 9 g，牡丹皮 9 g，澤瀉 9 g，桂枝3 g和附子3 g組成。中藥飲片煎煮后，4℃保存。金匱腎氣丸煎制后濃度為0.5 g/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 地塞米松：純度≥98%（HPLC）、脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-17（IL-17）檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；LC3BI/LC3BII、phosphorylated（p）-mTOR、mTOR 和 GAPDH 抗體購自 美 國 Cell Signaling Technology；Beclin-1、p62、AMPK和p-AMPK抗體購自英國Abcam；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 40只6周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房，環(huán)境溫度22～26℃，提供充足飲水及飼料。待大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 COPD模型的建立及分組給藥 40只SD大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，將其隨機(jī)分為空白對照組、COPD組、金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4 g/kg組和地塞米松組，每組各8只。除空白對照組外，其余組大鼠采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）法建立COPD大鼠模型[8]。COPD組、金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4g/kg組和地塞米松組在第1、14天于大鼠氣道內(nèi)注射200 μg LPS，在第2～13天和第15～28天每天給予兩次煙熏處理，每次持續(xù)30 min?？瞻讓φ战M氣道內(nèi)注射生理鹽水。在每次煙熏前1 h，金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4 g/kg組大鼠灌胃金匱腎氣丸3.7 g/kg和7.4 g/kg[9]，地塞米松組大鼠灌胃地塞米松（0.5 mg/kg）[10]，其余組灌胃等量溶劑（含2% DMSO的生理鹽水），持續(xù)給藥4周。

1.5 各組大鼠肺功能的測定 各組大鼠最后1次給藥24 h后，麻醉大鼠，AniRes 2005動物肺功能分析系統(tǒng)測定各組大鼠0.3 s用力呼氣量（FEV0.3）和呼出25% FVC氣量時(shí)的流速（FEV0.3/FVC%）、呼氣峰流速（PEF）、最大呼氣中段流量（MMF）、肺動態(tài)順應(yīng)性（CL）。

1.6 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的收集 各組大鼠最后1次給藥24 h后，麻醉后處死，氣管插管，生理鹽水灌洗肺部，隨后抽回生理鹽水，即為BALF。

1.7 BALF中 IL-1β、TNF-α、IL-6和 IL-17水平的檢測 BALF離心半徑10cm，3000r/min，離心5min，取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，檢測BALF上清液中 IL-1β、TNF-α、IL-6和 IL-17水平。

1.8 蘇木精-伊紅（HE）染色檢測大鼠肺組織病理學(xué)變化 各組大鼠最后1次給藥24 h后，麻醉后處死。取大鼠肺組織，4%多聚甲醛固定72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片進(jìn)行HE染色。評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分為無炎性浸潤，1分為氣道周圍有少量間歇性炎性細(xì)胞浸潤，2分為氣道周圍有1～5層炎性細(xì)胞浸潤，3分為氣道周圍有5層以上的炎性細(xì)胞浸潤[11]。

1.9 TUNEL染色檢測大鼠肺組織細(xì)胞凋亡 按照1.8所示，制備肺組織石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后，加入蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng) 30 min，PBS漂洗 3次，3% H2O2封閉10 min。滴加TUNEL反應(yīng)混合液，濕盒中37℃孵育1 h。PBS漂洗，加入轉(zhuǎn)化劑，濕盒中37℃孵育20 min。PBS漂洗，加入IDAB底物，反應(yīng)10 min。PBS漂洗后，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行400倍放大觀察，對視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算各組大鼠支氣管上皮細(xì)胞凋亡率。

1.10 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）檢測自噬及AMPK/mTOR途徑相關(guān)蛋白的表達(dá) 將各組大鼠肺組織剪碎，RIPA裂解液裂解組織，離心取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入一抗，4℃條件下孵育過夜。加入二抗室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測。Image-Pro Plus軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，對蛋白的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能的比較 與空白對照組相比，COPD組大鼠FEV0.3/FVC%、PEF、MMF和CL明顯降低（P＜0.05）；與COPD組相比，金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4g/kg組和地塞米松組大鼠FEV0.3/FVC%、PEF、MMF和CL明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺功能的比較（±s）Tab.1 Comparison of lung function of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠肺功能的比較（±s）Tab.1 Comparison of lung function of rats in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 COPD 組比較，#P＜0.05。

CL（mL/cmH2O）空白對照組 4.92±0.52 4.27±0.69 0.57±0.06 COPD 組 3.01±0.37*2.28±0.37*0.26±0.04*金匱腎氣丸 3.7g/kg組 4.00±0.51#3.31±0.48#0.39±0.05#金匱腎氣丸7.4g/kg組 4.45±0.53#3.48±0.63#0.46±0.06#地塞米松組 4.68±0.64#3.52±0.66#0.48±0.06#組別 PEF（mL/s）動物數(shù)FEV0.3/FVC%MMF（mL/s）8 8 8 8 8 0.94±0.09 0.61±0.07*0.79±0.09#0.83±0.08#0.89±0.09#

2.2 各組大鼠氣道炎癥的比較 與空白對照組相比，COPD 組大鼠 BALF 中 IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-17水平明顯升高（P＜0.05）；與 COPD 組相比，金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4 g/kg組和地塞米松組大鼠 BALF 中 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-17水平明顯降低（P＜0.05），且金匱腎氣丸作用呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β，TNF-α，IL-6 and IL-17 levels in BALF of rats in each group（±s） pg/mL

表2 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β，TNF-α，IL-6 and IL-17 levels in BALF of rats in each group（±s） pg/mL

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 COPD 組比較，#P＜0.05；與金匱腎氣丸 3.7 g/kg組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù) IL-1β TNF-α IL-6 IL-17空白對照組 8 32.58±4.75 23.57±3.18 36.22±4.53 25.74±3.37 COPD 組 8 118.42±12.97* 136.29±12.57* 317.16±24.51* 78.16±7.95*金匱腎氣丸 3.7 g/kg組 8 84.97±8.24# 102.16±9.65# 238.82±24.78# 63.22±5.01#金匱腎氣丸7.4 g/kg組 8 67.58±7.19#△ 65.23±6.92#△ 158.37±14.69#△ 52.41±4.87#△地塞米松組 8 63.27±7.58# 54.96±5.26# 135.13±14.21# 46.26±4.15#

2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 空白對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，與空白對照組相比，COPD組大鼠肺泡腔內(nèi)和氣道周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥評分明顯升高（P＜0.05）；與COPD組相比，金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4 g/kg組和地塞米松組大鼠肺組織病理學(xué)變化有明顯改善，炎癥評分明顯降低（P＜0.05），且金匱腎氣丸作用呈劑量依賴性。見圖1和表3。

表3 各組大鼠炎癥評分的比較（±s）Tab.3 Comparison of inflammation scores of rats in each group（±s） 分

表3 各組大鼠炎癥評分的比較（±s）Tab.3 Comparison of inflammation scores of rats in each group（±s） 分

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；COPD 組比較，#P＜0.05；與金匱腎氣丸 3.7 g/kg組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù) 炎癥評分空白對照組 8 0.25±0.03 COPD 組 8 2.39±0.28*金匱腎氣丸3.7g/kg組 8 1.82±0.15#金匱腎氣丸 7.4g/kg組 8 1.55±0.16#△地塞米松組 8 1.44±0.15#

圖1 HE染色檢測各組大鼠肺組織病理學(xué)變化（×200）Fig.1 HE staining to detect the pathological changes of rat lung tissue in each group(×200)

2.4 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的比較 與空白對照組相比，COPD組大鼠細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與COPD組相比，金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4 g/kg組和地塞米松組大鼠細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），且金匱腎氣丸作用呈劑量依賴性。見圖2和表4。

表4 各組大鼠支氣管上皮細(xì)胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of the apoptosis rate of rat bronchial epithelial cells in each group（±s）

表4 各組大鼠支氣管上皮細(xì)胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of the apoptosis rate of rat bronchial epithelial cells in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 COPD 組比較，#P＜0.05；與金匱腎氣丸 3.7 g/kg組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù) 細(xì)胞凋亡率（%）空白對照組 8 5.84±0.63 COPD 組 8 72.19±8.61*金匱腎氣丸3.7 g/kg組 8 18.48±2.25#金匱腎氣丸 7.4 g/kg組 8 8.92±0.95#△地塞米松組 8 8.74±0.97#

圖2 各組大鼠肺切片支氣管上皮細(xì)胞凋亡情況（×200，×400）Fig.2 Apoptosis of bronchial epithelial cells in lung slices of rats in each group(×200，×400)

2.5 各組大鼠肺組織自噬水平的比較 與空白對照組相比，COPD組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與 COPD 組相比，金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4 g/kg組和地塞米松組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），且金匱腎氣丸作用呈劑量依賴性。見圖3和表5。

表5 各組大鼠LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1和p62蛋白表達(dá)水平的比較（±s）Tab.5 Comparison of the protein expression levels of LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，Beclin1 and p62 in each group of rats（±s）

表5 各組大鼠LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1和p62蛋白表達(dá)水平的比較（±s）Tab.5 Comparison of the protein expression levels of LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，Beclin1 and p62 in each group of rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 COPD 組比較，#P＜0.05；與金匱腎氣丸 3.7 g/kg組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù) LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)Beclin1/GAPDH蛋白表達(dá)p62/GAPDH蛋白表達(dá)空白對照組 4 0.25±0.03 0.18±0.01 0.79±0.08 COPD 組 4 1.12±0.14* 0.95±0.10* 0.46±0.06*金匱腎氣丸3.7 g/kg組 4 0.83±0.07# 0.66±0.07# 0.58±0.05#金匱腎氣丸 7.4 g/kg組 4 0.31±0.02#△ 0.28±0.02#△ 0.74±0.06#△地塞米松組 4 0.27±0.03# 0.26±0.02# 0.76±0.08#

圖3 Western blot檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1和p62的蛋白表達(dá)Fig.3 Detection of the protein expression of LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，Beclin1 and p62 by Western blot

2.6 各組大鼠AMPK/mTOR途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與空白對照組相比，COPD組大鼠p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與COPD組相比，金匱腎氣丸3.7 g/kg組、金匱腎氣丸7.4 g/kg組和地塞米松組大鼠p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），且金匱腎氣丸作用呈劑量依賴性。見圖4和表6。

表6 各組大鼠p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR表達(dá)水平的比較（±s）Tab.6 Comparison of expression levels of p-AMPK/AMPK and p-mTOR/mTOR in each group of rats（±s）

表6 各組大鼠p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR表達(dá)水平的比較（±s）Tab.6 Comparison of expression levels of p-AMPK/AMPK and p-mTOR/mTOR in each group of rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 COPD 組比較，#P＜0.05；與金匱腎氣丸 3.7 g/kg組比較，△P＜0.05。

p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)空白對照組 4 0.41±0.05 1.27±0.11 COPD 組 4 0.87±0.08* 0.56±0.04*金匱腎氣丸 3.7 g/kg組 4 0.63±0.05# 0.89±0.09#金匱腎氣丸7.4 g/kg組 4 0.49±0.02#△ 1.16±0.12#△地塞米松組 4 0.54±0.03# 1.20±0.14#組別 動物數(shù) p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)

圖4 Western blot檢測p-AMPK、AMPK、p-mTOR和mTOR蛋白表達(dá)Fig.4 Detection of p-AMPK，AMPK，p-mTOR and mTOR protein expression by Western blot

3 討論

COPD是一種以慢性支氣管炎、氣道阻塞和肺氣腫為特征的進(jìn)行性疾病，是世界上居第四位的常見死亡原因[12]。支氣管擴(kuò)張劑、抗生素和皮質(zhì)類固醇聯(lián)合治療是目前COPD的主要治療方案。但該治療方案只能暫時(shí)緩解COPD癥狀，不能延緩疾病進(jìn)展或治愈疾病[13]。因此，開發(fā)新的COPD治療藥物刻不容緩。金匱腎氣丸為滋腎填精的代表方劑，常用于肝腎陽虧所致的各種疾病[4]。本研究以COPD為研究對象，旨在探究金匱腎氣丸對COPD的作用機(jī)制，以期為開發(fā)新的COPD治療藥物提供新的科學(xué)資料。

自限性炎癥反應(yīng)向慢性持續(xù)性炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)變與COPD發(fā)展相關(guān)，該過程涉及多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)[14]。在長期吸煙者的支氣管肺泡灌洗中發(fā)現(xiàn) TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12（p40）、IL-17、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP-1α）表達(dá)水平升高[15]。本研究采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴注LPS法建立COPD大鼠模型，結(jié)果顯示：COPD 大鼠肺功能降低，BALF 中 IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平升高，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。而金匱腎氣丸和地塞米松均可明顯改善COPD大鼠肺功能和肺組織病理學(xué)變化，抑制BALF中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平升高。該研究結(jié)果表明，金匱腎氣丸與地塞米松一樣在COPD中具有明顯的抗炎作用，可延緩COPD疾病進(jìn)程。

COPD的發(fā)展涉及多種機(jī)制：氧化應(yīng)激、氣道炎癥、異常自噬和細(xì)胞死亡等[16]。自噬是一種在各種刺激下維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的分解代謝過程。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）在香煙煙霧誘導(dǎo)的肺氣腫小鼠模型中激活了細(xì)胞凋亡，提示細(xì)胞自噬與肺病細(xì)胞凋亡有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，COPD大鼠細(xì)胞凋亡和自噬水平明顯升高，而金匱腎氣丸和地塞米松干預(yù)可抑制COPD大鼠細(xì)胞凋亡和自噬水平。該研究結(jié)果表明，金匱腎氣丸與地塞米松一樣通過抑制細(xì)胞凋亡和自噬水平，在COPD中發(fā)揮保護(hù)作用。

在人支氣管上皮細(xì)胞中，β-arrestin2通過AMPK/mTOR途徑抑制自噬，降低香煙煙霧誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)，在COPD中發(fā)揮保護(hù)作用[18]。雷帕霉素通過抑制mTOR磷酸化，激活自噬。這個(gè)過程伴隨著p62的表達(dá)減少和LC3的表達(dá)增加[19]。有研究表明人參皂苷單體化合物K通過調(diào)控AMPK/mTOR途徑抑制自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在氧氣和葡萄糖剝奪再灌注的神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用[20]。本研究結(jié)果表明COPD大鼠中p-AMPK/AMPK表達(dá)升高，而p-mTOR/mTOR表達(dá)降低，自噬和細(xì)胞凋亡水平升高。金匱腎氣丸和地塞米松干預(yù)可抑制p-AMPK/AMPK表達(dá)、自噬和細(xì)胞凋亡水平，促進(jìn)p-mTOR/mTOR表達(dá)。金匱腎氣丸與地塞米松一樣通過調(diào)控AMPK/mTOR途徑在COPD中發(fā)揮保護(hù)作用

綜上所述，金匱腎氣丸可能通過AMPK/mTOR途徑改善COPD大鼠肺功能和肺組織病理學(xué)變化，抑制氣道炎癥，抑制COPD大鼠自噬和細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果為明確金匱腎氣丸在COPD中的作用機(jī)制及開發(fā)新的治療藥物提供了新的思路。