郝雪斌 牛秀嶺 張海成 邵小秦 張春霞 王英/金宇保靈生物藥品有限公司 010100

弓艷春/內(nèi)蒙古自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 010051

BVD 和IBR 均為OIE 法定報告的動物疫病，在我國分別為三類和二類動物疫病，嚴重威脅養(yǎng)牛業(yè)的安全。該病的根治方法是陽性牛檢出與捕殺，而預(yù)防的主要措施是接種疫苗。國外已有大量BVD 和IBR 的商品化單苗或聯(lián)苗，但國內(nèi)由于起步較晚，對該兩種疾病未引起足夠重視，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所與金宇保靈生物藥品有限公司聯(lián)合研制的牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗實現(xiàn)了兩種病同時預(yù)防接種技術(shù)，解決目前國內(nèi)無疫苗的現(xiàn)實難題。針對目前BVD 和IBR 較為嚴重的流行形勢，采用流行優(yōu)勢毒株制備安全高效的滅活疫苗應(yīng)為防控這兩種疾病的首選。對其免疫效果進行評價，從而確定免疫評價方法，指導(dǎo)疫苗使用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 疫苗牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗（BVDV/NMG 株+IBRV/LY 株）3 批（批號：S19001、S19002、S19003）。由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.2 試驗動物2～6月齡健康易感牛（BVDV 血清中和抗體效價不高于1∶2 或ELISA 抗體陰性、IBRV 血清中和抗體效價不高于1∶2 或ELISA 抗體陰性、BVDV 抗原陰性、IBRV 抗原陰性）100 頭，購于錫林郭勒盟正藍旗和包頭市達茂旗。

1.1.3 檢測試劑盒、試劑BVDV 間接免疫熒光試劑盒購至中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

BVDV PCR 引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，預(yù)期擴增片段大小為288bp。

1.1.4 細胞中和試驗用細胞和抗原MDBK 傳代細胞，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

BVDV 中和試驗用病毒，為NMG 株：病毒含量為107.5TCID50/ml。由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

IBRV 中和試驗用病毒，為LY 株中和毒：病毒含量為108.0TCID50/mL。由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.5 試驗器材96 孔細胞培養(yǎng)板、移液器及配套尖頭、二氧化碳培養(yǎng)箱、1.5～2mL 離心管及架子、倒置顯微鏡、生物安全柜，旋渦混合器、德國BiometraPCR 擴增儀、Tanon-1600 凝膠成像系統(tǒng)、DYY-6C 電泳儀等均由金宇保靈生物藥品有限公司檢測中心提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫每批試驗疫苗免疫30 頭2～6 月齡健康易感牛（BVDV 血清中和抗體效價不高于1 ∶2 或ELISA 抗體陰性、IBRV 血清中和抗體效價不高于1 ∶2 或ELISA 抗體陰性、BVDV 抗原陰性、IBRV 抗原陰性），每頭牛頸部肌肉注射2mL 疫苗。3 批疫苗共免疫90 頭牛，并同條件飼養(yǎng)陰性對照試驗牛10 頭。初免后21d，以相同免疫劑量和免疫途徑進行二免。

1.2.2 采血及抗體檢測各批次免疫牛分別在一免14 日、21 日和二免后14 日、21 日、60 日、90 日、120 日、150 日、180 日分別采血分離血清檢測中和抗體。

1.2.3 BVDV、IBRV 血清中和抗體測定

（1）材料待檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性對照血清、病毒液、含2%新生牛血清的DMEM 細胞維持液、胰酶-EDTA 消化液、96 孔細胞培養(yǎng)板、移液器及配套尖頭、二氧化碳培養(yǎng)箱、1.5～2mL 離心管及架子、倒置顯微鏡、生物安全柜，旋渦混合器等。

（2）操作程序

1）血清滅活用前將待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清經(jīng)56℃熱滅活30min。

2）血清稀釋用含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基對滅活后的待檢樣品在96 孔細胞培養(yǎng)版中進行2 倍系列稀釋，每份血清加4 孔，每孔50μL。標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對照血清根據(jù)實際效價進行適當(dāng)稀釋（一般作1 ∶2 稀釋）。

3）中和用病毒稀釋用含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將中和用病毒稀釋到200TCID50/0.1mL。

4）中和向每份血清樣品的每個稀釋度中加入50μL 中和病毒工作液，振搖混勻后，置37℃中和1h，期間振搖2～3 次。

5）加細胞懸液將生長成良好單層的MDBK 細胞用胰酶-EDTA 消化液消化分散后，用生長液配制成含20 萬/mL 的細胞懸液同步加到血清-病毒中和孔中，每孔100μL。加樣完成后做好標(biāo)記，然后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3日。

6）試驗需做下列對照：

陽性血清對照：2 倍稀釋血清50μL +中和病毒工作液50μL +細胞懸液100μL。

陰性血清對照：2 倍稀釋血清5L0μL+中和病毒工作液50μL +細胞懸液100μL。

正常細胞對照：細胞懸液100μL+維持液100μL。

血清毒性對照：2 倍稀釋血清50μL+維持液50μLl +細胞懸液100μL。

中和病毒對照：中和病毒工作液50μL+稀釋液50μL +細胞懸液100μL。

7）結(jié)果判定

每天用倒置顯微鏡觀察細胞孔是否出現(xiàn)CPE，統(tǒng)計待檢血清病變孔數(shù)，按Reed-Muench 法計算血清中和抗體效價。試驗成立條件為：中和病毒對照、陰性血清對照應(yīng)出現(xiàn)CPE，血清毒性對照應(yīng)無血清毒性，陽性血清對照和正常細胞對照應(yīng)不出現(xiàn)CPE。

2 結(jié)果

2.1 免疫后牛不同時間BVDV 中和抗體滴度測定結(jié)果由表1、2 和圖1 可知，3 批疫苗二免后21日BVDV 和IBRV 抗體滴度達到最高峰并維持至90 日，比二免后其他時間段抗體滴度高，二免后180 日（6 個月）時BVDV 中和抗體滴度大于1:128在50%以上，顯示二聯(lián)滅活疫苗BVD 部分免疫原性良好。

表1 二免后牛不同時間BVDV 中和抗體滴度大于1 ∶128 比例

表2 二免后牛不同時間BVDV 中和抗體效價平均值（log2）

圖1 二免后牛不同時間BVDV 中和抗體效價消長規(guī)律

2.2 免疫后牛不同時間IBRV 中和抗體滴度測定結(jié)果由表3、4 和圖2 可知，3 批疫苗二免后21 日IBRV 抗體滴度達到最高峰并維持至90 日，比二免后其他時間段抗體滴度高，二免后180 日（6 個月）時IBRV 抗體中和抗體滴度大于1:64在55%以上，也顯示二聯(lián)滅活疫苗IBR 免疫原性良好。

表3 二免后不同時間IBRV 中和抗體滴度大于1 ∶64 比例

表4 二免后牛不同時間IBRV 中和抗體效價平均值（log2）

圖2 二免后牛不同時間IBRV 中和抗體效價消長規(guī)律

3 討論

試驗牛在免疫以后未出現(xiàn)精神食欲異常和其他不良反應(yīng)，說明疫苗使用安全，也反映出疫苗制備工藝中抗原純化徹底和熱源物質(zhì)控制嚴格。

通過牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗免疫后不同時間BVD 和IBR 中和抗體檢測表明，BVD 和IBR中和抗體在一免后14 日和21 日均不能達到較高的中和抗體滴度，只有進行二免才可以達到較高中和抗體滴度。從中和抗體達到高峰的時間分析，BVD 和IBR 兩種抗原在牛體免疫應(yīng)答并未互相拮抗，均在二免后21 日出現(xiàn)中和抗體高峰，與趙月蘭等2009 年制備牛病毒性腹瀉油乳劑滅活苗免疫效果評價和冷雪等2010 年評價牛傳染性鼻氣管炎滅活疫苗效力時抗體達到高滴度時間是一致的。并且高抗體滴度持續(xù)6月以上，此結(jié)論與1982 年Joseph R.Kolar 等完成的實驗結(jié)論也是一致的。表明該二聯(lián)滅活苗二免后維持6 月以上的高中和抗體水平是有保障的。

通過牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗免疫后不同時間BVD 和IBR 中和抗體滴度消長分析，從一次免疫后14 日中和抗體檢測表明IBR 產(chǎn)生中和抗體比BVD產(chǎn)生中和抗體要高，且中和抗體滴度IBR 比BVD 高一個滴度。二次免疫后21 日檢測表明BVD 和IBR 中和抗體滴度均達到1:128 以上，并維持90d 左右逐漸下降，值得注意的是在中和抗體滴度下降過程中發(fā)現(xiàn)IBR 中和抗體下降速度快于BVD 中和抗體下降速度。說明免疫牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗后產(chǎn)生抵御IBR 感染的中和抗體比抵御BVD 感染的中和的抗體產(chǎn)生更快，但BVD 中和抗體高滴度持續(xù)時間比IBR 長。

4 結(jié)論

牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗（BVDV/NMG 株+IBRV/LY 株）免疫牛后，一免后14 日產(chǎn)生抗體，二免后21 日平均抗體滴度達到最高值并維持至少90 日，隨時間延續(xù)抗體滴度逐步下降，到120 日時BVDV 中和抗體不低于1 ∶128 和IBRV 中和抗體不低于1 ∶64 在80%以上，180 日時BVDV 中和抗體不低于1 ∶128 在50%以上，IBRV 中和抗體不低于1 ∶64 在55%以上。說明該疫苗兩次免疫后牛維持較高BVDV 和IBRV 中和抗體至少6 個月，可以指導(dǎo)牛場免疫程序的制定，保護牛免受BVDV 和IBRV感染，提高牛場經(jīng)營效益。