簡(jiǎn)海鋒 梁惠平 岑柏宏 袁亞維

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科（廣州510095）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占膠質(zhì)瘤的57%［1-2］，GBM 增殖快、侵襲力強(qiáng)，且預(yù)后極差［3-4］。放射治療是針對(duì)GBM常規(guī)且有效的治療手段之一，它能有效殺滅腫瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)患者生存期［4］。放療使GBM細(xì)胞發(fā)生DNA 雙鏈斷裂，最終殺滅腫瘤細(xì)胞［5］。然而，GBM 極易發(fā)生放療抵抗，極大制約了放療效果［6］。GBM異質(zhì)性極高，存在EGFR過(guò)表達(dá)或EGFR VⅢ突變的腫瘤細(xì)胞亞群，它們主要經(jīng)EGFR 通路產(chǎn)生原發(fā)性放療抵抗，同時(shí)在反復(fù)多次照射過(guò)程中，發(fā)生輻射誘導(dǎo)EGFR 通路和NF-κB 通路激活，從而引起繼發(fā)性放療抵抗［7-8］。輻射后NF-κB 通路激活能夠通過(guò)激活乳腺癌相關(guān)基因1（BRCA1）、乳腺癌相關(guān)基因2（BRCA2）、非同源末端結(jié)合重組蛋白Ku70 及共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因（ATM）等基因，激活同源重組依賴的DNA 損傷修復(fù)過(guò)程［9-10］，而輻射后EGFR 通路激活可以介導(dǎo)PI3K/AKT/DNA-PK 等通路，促進(jìn)非同源末端連接依賴的DNA 損傷修復(fù)［11-12］。因此，EGFR 和NFκB 通路的激活共同促進(jìn)了GBM 輻射后的DNA 損傷修復(fù)，從而增強(qiáng)了GBM 輻射抵抗性。

GBM 的發(fā)生發(fā)展與P53 基因突變或蛋白功能失活有關(guān)，它在GBM 中突變率為30.25%［13］。PTEN抑癌基因在GBM 中突變率為30.75%，它可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞過(guò)度增殖［14］。MGMT 是編碼一類DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，通過(guò)將DNA 鳥(niǎo)嘌呤O6 位上的甲基轉(zhuǎn)移到本身半胱氨酸殘基上，從而修復(fù)DNA 損傷，降低烷化劑（如替莫唑胺）的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)腫瘤化療抵抗［15-16］。當(dāng)MGMT 啟動(dòng)子發(fā)生甲基化時(shí)，基因編碼受阻，MGMT 表達(dá)下降，增強(qiáng)腫瘤化療敏感性［17-19］。在GBM 中，MGMT 啟動(dòng)子甲基化率僅為44.7%［20］。

有研究指出，通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞NF-κB 的活性，可以下調(diào)MGMT 的表達(dá)，進(jìn)而增加其對(duì)替莫唑胺的化療敏感性［21］。此外，p53 突變型和MGMT高表達(dá)的GBM 細(xì)胞系擁有更強(qiáng)的放化療抵抗性，可能與其DNA 修復(fù)能力相關(guān)［22］。但關(guān)于EGFR、PTEN 與MGMT 之間的調(diào)控關(guān)系，目前仍未有明確報(bào)道。

目前國(guó)內(nèi)外少有關(guān)于不同基因型GBM 輻射抵抗性比較的報(bào)道，以及不同基因型GBM 輻射后，DNA 斷裂情況、NF-κB 通路與EGFR 通路的激活隨時(shí)間的變化情況目前尚不明確。本研究選取三種不同基因型GBM 細(xì)胞系（U87MG、U251MG、U118MG）為研究對(duì)象，通過(guò)比較它們的輻射抵抗性，及其輻射后DNA 斷裂情況、NF-κB 效應(yīng)分子（RELA/p65）及EGFR 激活的時(shí)間依賴性變化，為臨床使用放療增敏劑（NF-κB 抑制劑、EGFR 抑制劑）的最佳使用時(shí)間提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源GBM 細(xì)胞系（U87MG、U251MG、U118MG）購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS 緩沖液（美國(guó)GIBCO 公司），Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒（貝博生物科技有限公司），4%多聚甲醛溶液（永津生物科技有限公司）、2.5%結(jié)晶紫甲醇溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所），MGMT抗體（中國(guó)proteintech公司），Phoso-p65抗體、p65抗體、Phoso-EGFR 抗體、EGFR 抗體、γH2AX 抗體（美國(guó)abcam公司）、山羊抗兔二抗（美國(guó)Bioworld 公司），P53、PTEN 基因全外顯子引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基、5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 基因測(cè)序?qū)87MG、U251MG、U118MG 的P53、PTEN 基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序，由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)輻射后48 h，消化并制備細(xì)胞懸液，離心，PBS 洗滌，用1×Annexin V 結(jié)合液重懸細(xì)胞400 μL，加入5 μL Annexin V-FITC 染色液，4 ℃避光孵育15 min，再加入5 μL PI 染色液混勻，4 ℃避光孵育5 min，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡水平。

1.3.4 平板克隆形成輻射后24 h，接種1 000個(gè)/孔到六孔板中，加入4%多聚甲醛溶液固定，吸干后再加入2.5%結(jié)晶紫甲醇溶液避光固定，吸干后用自來(lái)水緩慢沖洗，晾干后拍照。

1.3.5 Western blot加入蛋白裂解液（含有1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸化酶抑制劑）提取細(xì)胞總蛋白，以BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量，用SDS-PAGE 分離蛋白，電轉(zhuǎn)法把蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%BSA封閉，加入一抗（MGMT 1∶1 000、Phoso-p65 1∶1 000、P65 1∶1 000、Phoso-EGFR 1∶1 000、EGFR 1∶1 000、γH2AX 1∶5 000、GAPDH 1∶10 000），4 ℃搖床過(guò)夜，TBST 洗膜，二抗（1∶3 000）常溫孵育2 h，TBST 洗膜，于化學(xué)發(fā)光成像儀中拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的基因型

2.1.1 P53 基因突變情況U87MG、U251MG、U118MG 的P53 基因全外顯子測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的P53 基因突變情況Fig.1 P53 gene mutations in different glioblastoma cell lines

2.1.2 PTEN 基因突變情況U87MG、U251MG、U118MG 的PTEN 基因全外顯子測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的PTEN 基因突變情況Fig.2 PTEN gene mutations in different glioblastoma cell lines

2.1.3 MGMT 的表達(dá)情況U87MG 與U251MG 低表達(dá)MGMT，提示U87MG 與U251MG 的MGMT 的啟動(dòng)子發(fā)生甲基化。U118MG 高表達(dá)MGMT，提示U118MG 的MGMT 的啟動(dòng)子無(wú)甲基化，見(jiàn)圖3。U87MG、U251MG、U118MG 的P53、PTEN、MGMT 突變或表達(dá)情況見(jiàn)表1。

表1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的基因突變情況Tab.1 Gene mutations in different glioblastoma cell lines

圖3 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系MGMT 的表達(dá)情況Fig.3 Expression of MGMT in different glioblastoma cell lines

2.2 不同基因型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系輻射抵抗性的比較

2.2.1 細(xì)胞凋亡水平的比較U87MG、U251MG、U118MG 分別經(jīng)過(guò)2、5、10 Gy 輻射后48 h，細(xì)胞凋亡水平的比較見(jiàn)圖4A，細(xì)胞凋亡率變化值的比較見(jiàn)圖4B?？梢?jiàn)，各劑量下凋亡率變化值：U87MG ＞U118MG ＞U251MG，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。

圖4 不同基因型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系不同劑量輻射后48 h 細(xì)胞凋亡水平的比較Fig.4 Comparison of apoptosis levels of 48 h cells after different doses of radiation in different genotypes of glioblastoma cell lines

2.2.2 平板克隆形成的比較U87MG、U251MG、U118MG 經(jīng)2 Gy 輻射后存活分?jǐn)?shù)分別為0.437、0.625、0.515，5 Gy 輻射后為0.087、0.195、0.12，10 Gy輻射后為0.001、0.004、0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。因此，存活能力大小為U251MG ＞U118MG ＞U87MG。

圖5 GBM 細(xì)胞系不同劑量輻射后平板克隆形成的情況Fig.5 Formation of GBM cell lines after different doses of radiation

2.3 不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系輻射后DNA 斷裂與NF-κB 效應(yīng)分子（p65）及EGFR 激活的比較

2.3.1 DNA斷裂情況的時(shí)間依賴性比較U87MG、U251MG、U118MG 分別經(jīng)過(guò)2、5 Gy 輻射后，γH2AX在1 h 后達(dá)到峰值，但5 Gy 輻射后γH2AX 上升程度明顯高于2 Gy 的γH2AX 上升程度，1 h 后逐漸下降，5 Gy 的γH2AX 下降速度明顯低于2 Gy，提示在5 Gy 輻射引起的DNA 斷裂情況比2 Gy 的嚴(yán)重。

U87MG、U251MG、U118MG 經(jīng)過(guò)2 Gy 輻射后48 h γH2AX 基本下降恢復(fù)至輻射前水平，提示三種細(xì)胞在2 Gy輻射后48 h DNA斷裂修復(fù)基本完成；而U87MG經(jīng)過(guò)5 Gy輻射后48 h γH2AX仍高于正常水平，提示U87MG 在5 Gy 輻射后48 h 仍存在明顯的DNA 斷裂，DNA 修復(fù)未完成；U251MG、U118MG經(jīng)過(guò)5 Gy 輻射后48 h γH2AX 下降至正常水平，提示U251MG、U118MG 經(jīng)過(guò)5 Gy 輻射后48 h DNA 斷裂基本修復(fù)完成，見(jiàn)圖6?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)2 Gy、5 Gy 輻射后，DNA 斷裂嚴(yán)重程度：U87MG ＞U118MG ＞U251MG。

圖6 DNA 損傷標(biāo)記蛋白（γH2AX）的時(shí)間依賴性比較Fig.6 Time-dependent comparison of DNA damage marker proteins（γH2AX）

2.3.2 NF-κB 效應(yīng)分子（p65）激活的時(shí)間依賴性比較U87MG、U251MG、U118MG 經(jīng)過(guò)2 Gy 輻射后1 h p65開(kāi)始激活，輻射后3 h p-P65表達(dá)上升到峰值，而后逐漸下降，輻射后48 h U87MG 的p-P65 表達(dá)仍未降至正常水平，而U251MG、U118MG 的p-P65 表達(dá)降至正常水平。提示2 Gy 輻射后48 h，U87MG 的NF-κB 效應(yīng)分子（p65）仍處于激活狀態(tài)，并介導(dǎo)DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，而U251MG、U118MG中NF-κB 激活介導(dǎo)的同源重組修復(fù)（HRR）過(guò)程已經(jīng)完成。

經(jīng)過(guò)5 Gy 輻射后，U87MG 在輻射后6 h p-P65表達(dá)上升到峰值，而且持續(xù)至24 h 才出現(xiàn)回落，在48 h 恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；U251MG 在輻射后1 h 達(dá)到峰值，而3 h 則開(kāi)始出現(xiàn)回落，6 h 基本恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；U118MG 在輻射后6 h 達(dá)到峰值，而在12 h后開(kāi)始回落，48 h 基本恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。這些結(jié)果表明p-P65 介導(dǎo)的HRR 通路的DNA 損傷修復(fù)能力大小為：U251MG ＞U118MG ＞U87MG，見(jiàn)圖7。

圖7 NF-κB 效應(yīng)分子（p65）激活的時(shí)間依賴性比較Fig.7 Time-dependent comparison of NF-κB effector molecule（p65）activation

2.3.3 EGFR 激活的時(shí)間依賴性比較U87MG、U251MG、U118MG 經(jīng)過(guò)2 Gy 輻射后6 h p-EGFR 表達(dá)上升到峰值，而后逐漸下降，輻射后48 h U87MG的p-EGFR 表達(dá)仍未降至正常水平，而U251MG、U118MG 的p-EGFR 表達(dá)降至正常水平。提示2 Gy輻射后48 h，U87MG 的EGFR 仍處于激活狀態(tài)，并介導(dǎo)DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，而U251MG、U118MG 中EGFR 激活介導(dǎo)的非同源末端連接（NHEJ）通路的DNA 損傷修復(fù)過(guò)程已經(jīng)完成。

經(jīng)過(guò)5 Gy 輻射后，U87MG 在輻射后12 h p-EGFR 表達(dá)上升到峰值，而且持續(xù)至24 h 才出現(xiàn)回落，在48 h 時(shí)，仍未恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；U251MG 在輻射后3 h 達(dá)到峰值，而6 h 則開(kāi)始出現(xiàn)回落，48 h 基本恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；U118MG 在輻射后6 h 達(dá)到峰值，而在24 h 后開(kāi)始回落，48 h 基本恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。

以上結(jié)果表明EGFR 介導(dǎo)的NHEJ 通路的DNA 損傷修復(fù)能力大小為：U251MG ＞U118MG ＞U87MG，見(jiàn)圖8。

圖8 EGFR 激活的時(shí)間依賴性比較Fig.8 Comparison of time-dependent EGFR activation

3 討論

本研究選取三種不同基因型GBM 細(xì)胞系（U87MG、U118MG、U251MG），均為p53 和PTEN 基因突變型，其中U118MG 高表達(dá)MGMT，U87MG 與U251MG 低表達(dá)MGMT。本研究發(fā)現(xiàn)輻射抵抗性：U251MG ＞U118MG ＞U87MG。說(shuō)明GBM 細(xì)胞系輻射抵抗性與其基因型具有相關(guān)性，初步提示臨床檢測(cè)GBM 基因型對(duì)預(yù)測(cè)其輻射抵抗性具有重要意義。

p53 是參與DNA 損傷反應(yīng)的重要蛋白之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生輕微DNA 損傷時(shí)，早期p53 會(huì)促進(jìn)MDM2、p21 等基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞周期停滯，而晚期p53 會(huì)促進(jìn)RAD51、RAD52 等基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重DNA 損傷時(shí)，p53 會(huì)促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制DNA 損傷修復(fù)，最終引起細(xì)胞凋亡［23］。因此，GBM接受放療劑量的輻射而發(fā)生嚴(yán)重DNA 損傷時(shí)，p53蛋白因突變而失去其介導(dǎo)凋亡和抑制DNA 損傷修復(fù)的作用，從而使得p53 基因突變型的GBM 的輻射抵抗性增強(qiáng)。此外，p53 突變型和MGMT 高表達(dá)的GBM 細(xì)胞系擁有更強(qiáng)的放化療抵抗性，可能與其DNA 較強(qiáng)修復(fù)能力相關(guān)［22］。在P53 突變的腫瘤細(xì)胞中，NF-κB 的激活增強(qiáng)［24］。而在細(xì)胞衰老過(guò)程中，p53-MDM2 途徑會(huì)下調(diào)EGFR 的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老［25］。

PTEN 也是參與DNA 損傷反應(yīng)的重要蛋白之一。PTEN 突變的腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA 損傷修復(fù)的能力更強(qiáng)，因此其輻射抵抗性更強(qiáng)［26］。此外，NF-κB的激活可以下調(diào)PTEN的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［27］。PTEN 可以抑制PI3K/AKT/mTOR 途徑，從而抑制細(xì)胞過(guò)度增殖，而EGFR 激活可以介導(dǎo)PI3K/AKT/mTOR 通路激活，促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度增殖，引起腫瘤進(jìn)展［28］。關(guān)于PTEN 與MGMT 之間的聯(lián)系，目前未有明確報(bào)道。

此外，本研究通過(guò)比較不同基因型GBM 細(xì)胞系在不同劑量（2、5 Gy）輻射后各時(shí)間點(diǎn)的DNA 斷裂情況、NF-κB 效應(yīng)分子（p65）以及EGFR 的激活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：輻射后DNA 斷裂嚴(yán)重程度：U87MG ＞U118MG ＞U251MG。NF-κB以及EGFR信號(hào)通路激活持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短均為：U251MG ＞U118MG ＞U87MG，表明NF-κB 介導(dǎo)的HRR 通路及EGFR 介導(dǎo)的NHEJ通路的DNA 損傷修復(fù)能力大小為：U251MG ＞U118MG ＞U87MG。

輻射后NF-κB 及EGFR 信號(hào)通路激活，促進(jìn)了GBM 輻射后的DNA損傷修復(fù)，增強(qiáng)輻射抵抗性［7-8］。目前，蛋白酶體抑制劑（如馬利佐米、硼替佐米等）為代表的NF-κB抑制劑已經(jīng)進(jìn)入GBM的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，它們可抑制NF-κB 抑制蛋白α（NF-κB inhibitor α，NFKBIA）的降解，從而抑制NF-κB 信號(hào)通路激活。GBM 存在EGFR 過(guò)表達(dá)或EGFR VⅢ突變的腫瘤細(xì)胞亞群［8］。此外，已有針對(duì)EGFR 突變的藥物上市應(yīng)用于治療GBM，主要有酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如奧希替尼、達(dá)克替尼等）與單克隆抗體（如帕尼單抗、西妥昔單抗等）［8，12，29-30］。結(jié)合本研究結(jié)果，輻射后NF-κB 與EGFR 信號(hào)通路激活具有的時(shí)間依賴性，使用NF-κB 抑制劑、EGFR 抑制劑聯(lián)合放射治療GBM 時(shí)，當(dāng)輻射后NF-κB 與EGFR信號(hào)通路達(dá)到激活峰值時(shí)，同時(shí)藥物在患者體內(nèi)達(dá)到最大腫瘤累積濃度時(shí)，可以更加有效抑制輻射后NF-κB 與EGFR 信號(hào)通路的激活，從而抑制DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，增強(qiáng)放療對(duì)GBM 的殺傷。

本研究可為進(jìn)一步研究GBM 的輻射抵抗性與其基因型的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床使用NF-κB 抑制劑與EGFR 抑制劑的最佳時(shí)間提供初步的理論依據(jù)，但輻射后NF-κB 與EGFR 信號(hào)通路的下游分子機(jī)制的劑量與時(shí)間依賴性仍需進(jìn)一步研究。