薛敏 任新軍 柯屹峰 劉巨平 范小娥 李筱榮

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)國際聯(lián)合研究中心 300384

高度近視是指近視屈光度>-6.00 D、眼軸長度>26.5 mm的屈光狀態(tài)，隨著眼軸長度的增加可導(dǎo)致后鞏膜葡萄腫、脈絡(luò)膜新生血管、脈絡(luò)膜/視網(wǎng)膜退行性病變等并發(fā)癥，從而嚴(yán)重影響視力，是低視力和致盲的主要原因之一[1]。據(jù)估計(jì)，到2050年，全球高度近視患者將達(dá)到9.38億人，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。高度近視的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，這也是目前仍缺乏有效防治近視措施的根本原因。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為探索高度近視的病理機(jī)制提供了新的思路。非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種不依賴于同位素標(biāo)記的新型蛋白質(zhì)定量技術(shù)，利用液相色譜和質(zhì)譜串聯(lián)對(duì)蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行分析，比較不同樣本中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度，通過解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量鑒定，已廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)志物篩選、疾病發(fā)病機(jī)制探索、新藥開發(fā)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3-4]。房水是一種重要的眼內(nèi)液，對(duì)維持眼的正常功能有重要意義，主要參與眼組織的物質(zhì)代謝及免疫反應(yīng)[5]。在眼部疾病發(fā)生和發(fā)展過程中，房水中的蛋白質(zhì)成分也會(huì)發(fā)生變化，并且與疾病的發(fā)病機(jī)制和/或預(yù)后有關(guān)[6-8]。探討高度近視眼房水蛋白組學(xué)變化能為深入了解高度近視的發(fā)病機(jī)制及開展高度近視的精準(zhǔn)防控提供重要參考，但目前關(guān)于房水蛋白質(zhì)組學(xué)變化與高度近視發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)測(cè)定高度近視患者房水中蛋白質(zhì)組學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源及分組 于2019年1—8月連續(xù)收集在天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院接受超聲乳化晶狀體摘出聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)的68例68眼年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的房水標(biāo)本，其中合并高度近視者和單純年齡相關(guān)性白內(nèi)障者各34例34眼，分別作為高度近視白內(nèi)障組和單純白內(nèi)障組。使用rpwr功能分析R軟件包計(jì)算樣本量，當(dāng)功效水平=0.8、效應(yīng)值=0.5、顯著性水平=0.05時(shí)，n=11.92?？紤]到臨床樣本研究中可能存在較大的個(gè)體差異，將樣本量擴(kuò)大到每組16例16眼進(jìn)行房水蛋白質(zhì)譜檢測(cè)分析，另取每組18例18眼采用ELISA法對(duì)質(zhì)譜法測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。高度近視白內(nèi)障組納入標(biāo)準(zhǔn)：眼軸長度≥26.5 mm，近視屈光度>-6.00 D，明顯豹紋樣眼底改變。單純白內(nèi)障組納入標(biāo)準(zhǔn)：眼軸長度為22.0～24.0 mm，屈光度<-0.5 D，不伴有任何眼底病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：有眼外傷史者；有高度近視相關(guān)并發(fā)癥治療史者；有除白內(nèi)障或高度近視外的其他眼病者；使用全身抗代謝藥物、免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素等者。2個(gè)組患者性別構(gòu)成比、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；眼軸長度、屈光度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。本研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[批文號(hào)：2020KY(L)-40]。所有患者對(duì)研究方法和目的知情并簽署知情同意書。

表1 2個(gè)組房水標(biāo)本來源患者基線特征比較Table 1 Comparison of demography between the two groups組別例數(shù)/眼數(shù)性別構(gòu)成比a(男/女,n)年齡b(mean±SD,歲)眼軸長度b(mean±SD,mm)屈光度b(mean±SD,D)LOCSⅡ高度近視白內(nèi)障組16/168/858.3±4.028.23±1.26-12.12±2.83C2N2P2單純白內(nèi)障組16/167/956.9±5.823.27±0.53-0.14±0.31C2N2P2χ2/t值0.1250.95017.160-34.346-P值0.7230.350<0.01<0.01- 注:(a: χ2檢驗(yàn);b:獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) LOCSⅡ:晶狀體混濁程度分類系統(tǒng)Ⅱ;-:未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Note:(a:χ2 test;b:Independent-samples t test) LOCSⅡ:lens opacities classification system Ⅱ;-:statistical analysis not performed

1.1.2主要試劑及儀器 鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%聚維酮碘溶液(上海利康消毒高科技有限公司)；BCA試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物有限公司)；胰蛋白酶(美國Promega公司)。裂隙燈顯微鏡(日本Topcon公司)；雙目間接檢眼鏡(德國Keeler公司)；IOLMaster光學(xué)生物測(cè)量儀、手術(shù)顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Nanodrop分光光度計(jì)(美國Thermo公司)；Ekspertnano LC 415液相色譜、TripleTOF 6600質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司)。

1.2 方法

1.2.1房水樣本的收集及處理 (1)標(biāo)本收集 術(shù)眼采用鹽酸奧布卡因滴眼液點(diǎn)眼行表面麻醉，采用0.5%聚維酮碘溶液沖洗結(jié)膜囊2次，平衡鹽溶液充分沖洗結(jié)膜囊。為了避免血紅蛋白及其他眼表污染物，在行任何眼內(nèi)操作之前于手術(shù)顯微鏡下用1 ml結(jié)核菌素注射器在透明角膜緣處穿刺進(jìn)入前房，采集房水標(biāo)本100 μl，迅速轉(zhuǎn)移至EP管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?2)樣品的制備 在50 μl房水中加入8 mol/L尿素裂解液350 μl，室溫下裂解5 min。冰上超聲破碎，超聲能量比例為35%，超聲3 s后停3 s，間斷超聲2 min。15 ℃下16 000×g離心10 min。取上清，采用BCA試劑盒測(cè)定房水標(biāo)本中蛋白濃度。取100 μg蛋白，加入濃度為1 mol/L的二硫蘇糖醇1 μl，37 ℃孵育1 h。加入濃度為1 mol/L的吲哚乙酸4 μl，避光、37 ℃孵育1 h。平衡相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 000超濾管1次(加入濃度為50 mmol/L的碳酸氫銨400 μl，14 000×g離心10 min)，加入100 μg還原烷基化后的樣本，15 ℃下14 000×g離心20 min，加入400 μl碳酸氫銨清洗3次，更換收集管，加入50 μl碳酸氫銨至超濾管中，加入2 μg測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，37 ℃孵育12～16 h。用移液槍混勻超濾管中的樣本，4 ℃下14 000×g離心20 min，加50 μl碳酸氫銨沖洗3次，向收集管中加入體積分?jǐn)?shù)1%的甲酸終止酶切，60 ℃下真空蒸干。取12 μl體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸重懸樣本，Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)量濃度，取等量的肽段進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.2非標(biāo)記液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)房水標(biāo)本中差異表達(dá)蛋白 采用Ekspertnano LC 415液相色譜和TripleTOF 6600質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定房水中蛋白質(zhì)。用上樣緩沖液(體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸、2%乙腈、97.9%水)將2 μg酶切后的肽段載入到C18填充的離子阱上(100 μm×2 cm，填料規(guī)格為3 μm，120 A)。使用梯度緩沖液(0.1%甲酸、97.9%乙腈、2%水)洗脫離子阱，肽段經(jīng)過C18填充的柱子后(150 μm×15 cm，填料規(guī)格為1.9 μm，120 A)，形成帶電的離子噴霧，離子噴霧進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。梯度緩沖液的有效洗脫梯度為5%～35%，有效時(shí)間為91 min，流速為400 nl/min。質(zhì)譜參數(shù)：飛行時(shí)間質(zhì)譜累加時(shí)間為0.25 s，質(zhì)量掃描范圍為300～1 500 m/z，電荷選擇+2～+5價(jià)離子，質(zhì)量偏差50 ppm以內(nèi)，每個(gè)循環(huán)內(nèi)最大監(jiān)測(cè)離子數(shù)為60，每次檢測(cè)隔離已檢測(cè)離子16 s，碎裂能量模式選擇動(dòng)態(tài)碎裂模式。產(chǎn)物離子累加時(shí)間為0.04 s，采用高靈敏掃描模式。采用Maxquant軟件(版本1.6.3.4)對(duì)質(zhì)譜采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Uniprot人類數(shù)據(jù)庫的搜索。對(duì)人類數(shù)據(jù)庫搜索后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選P值<0.05且差異倍數(shù)大于2的差異表達(dá)蛋白，對(duì)每個(gè)可定量蛋白的變化倍數(shù)以2為底數(shù)取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，將P值以10為底數(shù)取負(fù)對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)得到差異表達(dá)蛋白的火山圖。

1.2.3生物信息學(xué)法對(duì)房水中差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析 為進(jìn)一步探索差異表達(dá)蛋白的功能，用基因本體(Gene Ontology，GO)(http://geneontology.org/)功能注釋對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞成分功能分析。進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)通路注釋分析，以深入了解這些差異表達(dá)蛋白參與的重要代謝和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.2.4ELISA法對(duì)質(zhì)譜測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證 從主要差異表達(dá)蛋白中隨機(jī)選取3個(gè)蛋白(C8B、DAG1、TGFBI)，采用ELISA法對(duì)質(zhì)譜測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。步驟如下：(1)標(biāo)準(zhǔn)品的加樣 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；(2)加樣 分別設(shè)空白孔和待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，再加待測(cè)樣品10 μl。(3)加酶 每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl，空白孔除外。(4)溫育 用封板膜封板后37 ℃溫育60 min。(5)配液 將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。(6)洗滌 小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。(7)顯色 每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。(8)終止 每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。(9)測(cè)定 以空白孔調(diào)零，波長450 nm處依序測(cè)量各孔的吸光度(A)值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)證實(shí)符合正態(tài)分布，以mean±SD表示，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示。高度近視白內(nèi)障組與單純白內(nèi)障組間計(jì)數(shù)資料差異比較采用χ2檢驗(yàn)，組間計(jì)量資料差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2個(gè)組房水標(biāo)本中蛋白質(zhì)量濃度比較

高度近視白內(nèi)障組房水標(biāo)本平均蛋白質(zhì)量濃度為(1 134.91±104.78)ng/L，明顯高于單純白內(nèi)障組的(706.71±85.43)ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.977，P<0.01)。

2.2 2個(gè)組房水標(biāo)本中差異表達(dá)蛋白

2個(gè)組房水標(biāo)本中共鑒定出可定量蛋白463個(gè)，高度近視白內(nèi)障組與單純白內(nèi)障組房水標(biāo)本比較有86個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括49個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白和37個(gè)表達(dá)下調(diào)蛋白。表達(dá)上調(diào)蛋白主要為單核細(xì)胞分化抗原CD14、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin-Ⅲ，SERPINC1)、補(bǔ)體4B(complement 4B，C4B)、C9、C8B、C3和血漿蛋白酶C1抑制劑(plasma protease C1 inhibitor，SERPING1)。表達(dá)下調(diào)蛋白主要為生長因子β誘導(dǎo)蛋白(transforming growth factor-β-induced protein，TGFBI)、肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)糖蛋白1(dystroglycan 1，DAG1)、膠原蛋白4A1[collagen alpha-1(Ⅳ)chain，COL4A1]、骨橋蛋白(osteopontin，SPP1)和COL5A1等(圖1，表2)。差異表達(dá)蛋白的分類主要是蛋白結(jié)合活性調(diào)節(jié)因子(PC00095)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(PC00102)、載體蛋白(PC00219)、細(xì)胞間信號(hào)分子(PC00207)、蛋白質(zhì)修飾酶(PC00260)和代謝物間轉(zhuǎn)換酶(PC00262)，分別占32.7%、14.5%、9.1%、9.1%、7.3%和5.5%，轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(PC00227)、支架蛋白(PC00226)、細(xì)胞黏附分子(PC00069)、核酸結(jié)合蛋白(PC00171)、跨膜信號(hào)受體(PC00197)和防御/免疫蛋白(PC00090)均占3.6%(圖2)。

圖1 差異表達(dá)蛋白火山圖 藍(lán)色表示表達(dá)下調(diào)蛋白，紅色表示表達(dá)上調(diào)蛋白，灰色表示組間表達(dá)量無差異蛋白 FC：倍數(shù)變化

表2 高度近視白內(nèi)障組和單純白內(nèi)障組房水標(biāo)本中主要差異表達(dá)蛋白情況Table 2 Main differentially expressed proteins in the aqueous humor samples between the high myopia cataract group and simple cataract group蛋白名稱差異倍數(shù)P值表達(dá)變化CD1445.230.000003上調(diào)SERPINC134.520.000230上調(diào)C4B31.420.000041上調(diào)C928.670.000354上調(diào)C8B25.760.002416上調(diào)C325.420.006834上調(diào)SERPING114.650.002546上調(diào)DAG10.020.030506下調(diào)TGFBI0.060.000436下調(diào)COL4A10.120.000013下調(diào)SPP10.100.001437下調(diào)COL5A10.230.002531下調(diào) 注:SERPINC1:抗凝血酶Ⅲ;C4B:補(bǔ)體4B;SERPING1:血漿蛋白C1抑制劑;DAG1:肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)糖蛋白1;TGFBI:轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白;COL4A1:膠原蛋白4A1;SPP1:骨橋蛋白 Note:SERPINC1:antithrombin-Ⅲ;C4B:complement 4B;SERPING1:plasma protease C1 inhibitor;DAG1:dystroglycan 1;TGFBI:transforming growth factor-β-induced protein;COL4A1:collagen alpha-1(Ⅳ)chain;SPP1:osteopontin

圖2 2個(gè)組房水標(biāo)本中差異表達(dá)蛋白分類 橫坐標(biāo)表示差異表達(dá)蛋白的分類，縱坐標(biāo)表示各分類在86個(gè)差異表達(dá)蛋白中所占數(shù)量的百分比

2.3 2個(gè)組生物信息學(xué)分析

2.3.1GO分析 86個(gè)差異表達(dá)蛋白與不同的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞成分有關(guān)，這3個(gè)方面的前10條重要功能條目和相應(yīng)的差異表達(dá)蛋白數(shù)目顯示見圖3。差異表達(dá)蛋白主要富集在補(bǔ)體激活及其調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、急性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞蛋白代謝等生物學(xué)過程以及絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、內(nèi)肽酶抑制劑活性、肝素結(jié)合和晶狀體的結(jié)構(gòu)組成等分子功能；在細(xì)胞組分方面，差異表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外間隙、血液微粒和細(xì)胞外囊泡等。

圖3 2個(gè)組差異表達(dá)蛋白GO分析結(jié)果 A：“生物學(xué)過程”前10條富集結(jié)果 B：“分子功能”前10條富集結(jié)果 C：“細(xì)胞組分”前10條富集結(jié)果

2.3.2KEGG分析 86個(gè)差異表達(dá)蛋白富集于12條代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(表3)。21個(gè)差異表達(dá)蛋白富集于補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路，15個(gè)差異表達(dá)蛋白富集于細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路，8個(gè)差異表達(dá)蛋白富集于PI3K-Akt信號(hào)通路。

2.4 2個(gè)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)驗(yàn)證

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，高度近視白內(nèi)障組中隨機(jī)選擇的C8B蛋白表達(dá)量為(127.300±3.132)pg/ml，明顯高于單純白內(nèi)障組的(109.200±2.904)pg/ml，高度近視白內(nèi)障組中隨機(jī)選擇的DAG1和TGFBI蛋白表達(dá)量分別為(24.320±1.608)ng/ml和(626.900±23.110)pg/ml，明顯低于單純白內(nèi)障組的(30.900±2.183)和(725.500±24.660)pg/ml，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.233，P<0.01；t=2.426，P=0.020；t=2.918，P=0.006)，表達(dá)變化趨勢(shì)與非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果均一致(圖4)。

表3 2個(gè)組差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集結(jié)果Table 3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins between the two groups編號(hào)通路名稱差異表達(dá)蛋白數(shù)目P值hsa04610補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)211.55×10-20hsa04512細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用154.16×10-11hsa04151PI3K-Akt信號(hào)通路85.26×10-8hsa05146阿米巴病71.31×10-5hsa05322系統(tǒng)性紅斑狼瘡65.28×10-4hsa05133百日咳55.28×10-4hsa05150金黃色葡萄球菌感染40.002506hsa04974蛋白質(zhì)的消化和吸收40.009854hsa05020朊病毒疾病30.012741hsa05134軍團(tuán)桿菌病30.030506hsa03320PPAR信號(hào)通路30.045245hsa05222小細(xì)胞肺癌30.069051 注:KEGG:京都基因與基因組百科全書 Note:KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

圖4 2個(gè)組隨機(jī)選擇的3個(gè)差異表達(dá)蛋白ELISA驗(yàn)證 與單純白內(nèi)障組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=36) A:2個(gè)組C8B表達(dá)量比較 B:2個(gè)組DAG1表達(dá)量比較 C:2個(gè)組TGFBI表達(dá)量比較 1：高度近視白內(nèi)障組；2：單純白內(nèi)障組 C8B:補(bǔ)體8B;DAG1:肌營養(yǎng)不良相關(guān)糖蛋白1;TGFBI:轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白

3 討論

目前,高度近視仍缺乏有效的治療手段，當(dāng)其出現(xiàn)脈絡(luò)膜新生血管、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜退行性病變時(shí)將嚴(yán)重影響患者視力，甚至致盲，因此積極尋找高度近視的潛在發(fā)病機(jī)制，開發(fā)有效的治療靶點(diǎn)，并預(yù)測(cè)其進(jìn)展和預(yù)后具有重要意義。房水是維持眼正常功能的重要眼內(nèi)液，研究表明房水蛋白質(zhì)組與眼部疾病密切相關(guān)，包括角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜等結(jié)構(gòu)病變，在眼部正常穩(wěn)態(tài)被破壞后，房水中的蛋白質(zhì)量和種類也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，甚至有些蛋白可以被用來作為疾病診斷或治療的生物標(biāo)志物[9-13]。在本研究中，32個(gè)房水標(biāo)本共鑒定出463種蛋白質(zhì)，與單純白內(nèi)障組相比,高度近視白內(nèi)障組中發(fā)現(xiàn)49種上調(diào)蛋白和37種下調(diào)蛋白。在另一項(xiàng)與高度近視相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，10個(gè)房水標(biāo)本發(fā)現(xiàn)有210種差異表達(dá)蛋白，包括123種上調(diào)蛋白和87種下調(diào)蛋白[14]。對(duì)比這2項(xiàng)高度近視蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，很多變化明顯的差異表達(dá)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)都是一致的，如CD14、C8B、C4B和COL4A1等。本研究通過GO富集分析和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)免疫和炎癥的相互作用以及細(xì)胞外基質(zhì)重塑在高度近視的發(fā)病機(jī)制中起著主要作用。

KEGG通路分析表明，富集度最顯著的為補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路，包含21個(gè)差異表達(dá)蛋白，與GO分析結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道，這些蛋白質(zhì)中的大多數(shù)具有促炎功能，其中一些在近視患者中已被發(fā)現(xiàn)有上調(diào)趨勢(shì)[15-16]。此外，其他KEGG富集通路(PI3K-Akt信號(hào)通路、阿米巴病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、百日咳、金黃色葡萄球菌感染、朊病毒疾病、軍團(tuán)桿菌病、PPAR信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌)都與免疫和炎癥相互作用有關(guān)。GO分析也表明，差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)過程在補(bǔ)體激活和急性炎癥反應(yīng)中富集度高。Serpin家族中許多炎癥蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，如Serpinc1、Serping1等。Wei等[16]報(bào)道，鞏膜和脈絡(luò)膜的急性炎癥會(huì)導(dǎo)致近視，這表明炎癥可能在近視的進(jìn)展中起作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、葡萄膜炎或脈絡(luò)膜炎等免疫炎癥性疾病患者的近視發(fā)生率較高。以上研究表明炎癥可能影響近視的發(fā)展。此外，有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體系統(tǒng)在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變和年齡相關(guān)性黃斑變性等多種眼部疾病表達(dá)紊亂[17-18]。在本研究中，許多差異表達(dá)蛋白，如C8B、C9、C4B、C3等，是參與補(bǔ)體激活和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵免疫蛋白，在高度近視白內(nèi)障組中明顯上調(diào)。差異表達(dá)蛋白的GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白主要富集到補(bǔ)體激活和調(diào)節(jié)生物學(xué)過程中，提示高度近視患者存在免疫調(diào)節(jié)活化。由此可見，補(bǔ)體激活與炎癥的相互作用在高度近視的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。免疫和炎癥相關(guān)治療可能是高度近視一種新的臨床治療策略，可能成為未來的一個(gè)研究方向。

在本研究中，多種差異表達(dá)蛋白為支架蛋白和細(xì)胞黏附分子(如COL4A1、COL5A1和SPP1)，且KEGG分析中高度富集了細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路，這些均與GO分析結(jié)果一致。DAG1是肌營養(yǎng)不良蛋白-糖蛋白復(fù)合物的組成成分，參與了細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)之間附著的主要作用機(jī)制，經(jīng)常在肌-眼-腦綜合征的研究中被報(bào)道[19]。肌-眼-腦綜合征患者常合并嚴(yán)重的先天性近視，其致病機(jī)制之一就是外周膜蛋白DAG1糖基化異常[20]。與單純白內(nèi)障組相比，高度近視白內(nèi)障組TGFBI明顯下降，這與另一項(xiàng)有關(guān)高度近視蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致[14]。TGFBI蛋白是一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，已被證實(shí)能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的附著[21]。鞏膜合成和分泌TGFBI蛋白，在促進(jìn)與近視發(fā)展相關(guān)的鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起著重要作用[22]。TGFBI蛋白可調(diào)節(jié)人鞏膜成纖維細(xì)胞在成纖維細(xì)胞層界面上附著于I型膠原，從而調(diào)節(jié)層狀滑移量、鞏膜黏彈性和鞏膜延長速率[22]。雖然導(dǎo)致高度近視發(fā)生和發(fā)展的病因尚不清楚，但這些與鞏膜生物力學(xué)特性改變有關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)生化變化被認(rèn)為是導(dǎo)致眼軸增長和近視發(fā)展的原因。

本研究通過非標(biāo)記定量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，高度近視患者房水蛋白質(zhì)組譜發(fā)生了顯著變化,并通過了ELISA實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。生物信息學(xué)分析表明這些差異表達(dá)蛋白與免疫和炎癥相互作用以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑密切相關(guān)。研究結(jié)果為免疫炎癥相互作用和細(xì)胞外基質(zhì)重塑在高度近視中發(fā)揮重要作用提供了新證據(jù)，但其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究的不足之處在于,由于臨床樣本取材的限制，無法獲得年輕的高度近視患者和正常人的房水樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但本研究在最大程度上控制了2個(gè)組白內(nèi)障基線病情的一致性，從而降低了白內(nèi)障對(duì)研究結(jié)果的影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突