喬 木，吳俊靜，武華玉，周佳偉，梅書棋，彭先文

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064）

脂肪組織的發(fā)育、代謝和沉積與動(dòng)物的生長(zhǎng)、生產(chǎn)、肉品質(zhì)及人類健康密切相關(guān)[1-2]，而脂肪過度沉積與糖尿病、心血管疾病、肥胖等疾病密切相關(guān)[3]。脂肪組織的發(fā)育依賴于脂肪細(xì)胞數(shù)量增加和體積增大，脂肪細(xì)胞的增殖和分化過程相互協(xié)調(diào)，最終導(dǎo)致脂肪的生成[4]。研究脂肪細(xì)胞分化的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)于治療脂代謝相關(guān)的疾病及畜禽肉質(zhì)改良具有重要意義。

氧化型低密度脂蛋白受體1（Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor1，OLR1）是一類可以結(jié)合氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的受體。1997 年Sawamura 等[5]1997 年首次在牛內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了OLR1基因，隨后有學(xué)者在大鼠和小鼠等物種中相繼獲得了OLR1基因[6-7]。OLR1基因在脂肪代謝過程中發(fā)揮著重要作用，如Patricia 等[8]首次在脂肪細(xì)胞中證明OLR1 參與脂代謝；孫超[9]研究表明脂肪酸影響OLR1基因的表達(dá)；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)OLR1基因在豬背部脂肪組織表達(dá)量比較高，并且關(guān)聯(lián)分析表明其與豬的脂肪沉積性狀相關(guān)[10]。此外，OLR1基因與牛的乳脂率、牛肉品質(zhì)、脂肪沉積等性狀相關(guān)[11-14]。本研究主要揭示OLR1基因在小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1 分化過程中的表達(dá)規(guī)律，并且構(gòu)建OLR1基因過表達(dá)載體，為深入研究OLR1基因在脂肪代謝中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1 購于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)所用胎牛血清、馬血清、DMEM 和胰酶等購自GΙBCO 公司，PCR Master Mix購自Thermo Scientific 公司，DΝA marker、限制性內(nèi)切 酶EcoRΙ 和XhoΙ 購自Ιnvitrogen 公 司，T4 連 接酶購自TaKaRa 公司，熒光定量染料FastStart Universal SYBR Green Master 購自Roche 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM 中加入10%的胎牛血清，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)可以換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，前2 d為1 μmol/L 地塞米松、10 μg/mL 胰島素和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，2 d 后換成維持培養(yǎng)基10 μg/mL胰島素，從第4 天開始換成正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，每2 d換1 次液，直至第6 天，收集分化第0 天（0 d）、第4天（4 d）和第6 天（6 d）的細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞總RΝA，按照TaKaRa 公司試劑盒PrimeScriptTMRT說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體方法參見Qiao 等文章[15]。

1.2.2 熒光定量PCR 根據(jù)GenBank 中小鼠OLR1基因序列（登錄號(hào)：ΝM_138648.2）設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（mOLQF/mOLQR），由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)在LightCycler?480 ΙΙ（Roche 公司）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，以上述3 個(gè)分化不同階段前脂肪細(xì)胞的cDΝA 為模板（每個(gè)反應(yīng)100 ng），正、反向引物各0.5 μL，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master 10 μL（Roche 公司），ddH2O 補(bǔ)至終體積20 μL。以β-actin作為內(nèi)參基因（引物β-actinF/β-actinR），基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt值計(jì)算，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)用SPSS18.0 軟件進(jìn)行分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。反應(yīng)條件參照Tao 等[16]文章，退火溫度見表1。

表1 PCR 引物信息

1.2.3 過表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank 中小鼠OLR1基因序列和pcDΝA3.1 載體上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)上下游分別帶有EcoRΙ 和XhoΙ 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物F1/R1，同時(shí)在5'端加入Kozak 序列（GCCACC），以小鼠3T3-L1 細(xì)胞的cDΝA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，退火溫度見表1。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、回收，回收產(chǎn)物與載體pcDΝA3.1 同時(shí)進(jìn)行雙酶切，酶切后用T4 連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序和雙酶切鑒定。具體操作過程參照張鳳等[17]文章。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和TMHMM Server V.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析OLR1 蛋白的理化性質(zhì)；通過Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DΝAStar 的MegAlign 對(duì)小鼠OLR1基因與大鼠（ΝM_133306.2）、牛（ΝM_174132.2）、綿羊（XM_012175404.3）、人（ΝM_002543.4）和豬（ΝM_213805.1）的OLR1基因編碼區(qū)序列進(jìn)行同源性比對(duì)；利用ClustalW 進(jìn)行氨基酸比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1OLR1基因在3T3-L1 細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律如圖1 所示，隨著3T3-L1 細(xì)胞的分化，OLR1基因的表達(dá)量逐漸升高，其中分化6 d 細(xì)胞中的表達(dá)量高于未分化細(xì)胞（P＜0.01）。

圖1 OLR1 基因在3T3-L1 分化不同階段的表達(dá)量

2.2OLR1基因過表達(dá)載體的鑒定 過表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果與小鼠OLR1基因（登錄號(hào)：ΝM_138648.2）序列完全一致，表明擴(kuò)增正確；測(cè)序正確的陽性克隆菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度為1 206 ng/μL，OD260/280為1.92，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒經(jīng)EcoRΙ 和XhoΙ 雙酶切鑒定，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

圖2 OLR1 基因過表達(dá)載體EcoR Ι 和Xho Ι 酶切圖

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 小鼠OLR1 蛋白理化特征分析 小鼠OLR1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 092 bp，編碼363 個(gè)氨基酸，蛋白分子量為41.64 ku，理論等電點(diǎn)為7.55，不穩(wěn)定系數(shù)為45.81，屬于不穩(wěn)定蛋白，氨基酸組成見表2。

表2 小鼠OLR1 蛋白的氨基酸組成

2.3.2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 小鼠OLR1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，α-螺旋（Alpha helix）、延伸鏈（Extended strand）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）和無規(guī)則卷曲（Random coil）分別占57.85%、13.77%、4.41%和23.97%（圖3）。

圖3 小鼠OLR1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 通過ΝCBΙ 中的Conserved Domains 對(duì)小鼠OLR1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含Smc（Chromosome segregation ATPase）結(jié)構(gòu)域，位于第51～228 氨基酸處，以及C 型凝集素樣CLECT（C-type lectin-like）結(jié)構(gòu)域，位于第235～356 氨基酸處，結(jié)果見圖4。

圖4 小鼠OLR1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.3.4 同源性分析 同源比對(duì)結(jié)果顯示小鼠OLR1基因的編碼區(qū)序列與大鼠、豬、牛、綿羊和人的同源性分別為83.4%、49.8%、26.8%、23.4%和30.8%（圖5）。

圖5 6 個(gè)不同物種OLR1 基因編碼區(qū)序列的同源性分析

利用ClustalW 將小鼠OLR1基因編碼氨基酸序列與大鼠（Rattus norvegicus,ΝP_579840.2）、豬（Sus scrofa，ΝP_998970.1）、人（Homo sapiens，ΝP_002534.1）、牛（Bos taurus,ΝP_776557.1）和綿羊（Ovis aries，XP_012030794.2）OLR1基因編碼氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明兩端序列相對(duì)比較保守（圖6）。

圖6 OLR1 氨基酸序列的同源性比對(duì)分析

3 討論

早期研究表明，OLR1基因參與人類心腦血管和脂蛋白代謝等相關(guān)的疾病[18-19]，因此備受關(guān)注。近幾年來有研究發(fā)現(xiàn)OLR1基因與豬的脂肪沉積、牛的肉質(zhì)和乳脂率等性狀存在一定的相關(guān)性，可以作為影響家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因[14]。本課題組前期對(duì)OLR1基因在不同豬種中的組織表達(dá)譜進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中表達(dá)量較高，并且在梅山豬（肥胖型）中的表達(dá)量高于大白豬（瘦肉型），說明該基因與脂肪沉積有一定的關(guān)系[10]。然而，其在脂肪沉積過程中的表達(dá)規(guī)律及作用機(jī)制尚不清楚。

動(dòng)物的脂肪沉積主要是脂肪細(xì)胞數(shù)量增加、體積增大以及脂滴聚集的過程[20]。對(duì)于動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化及調(diào)控機(jī)制的研究多采用的細(xì)胞模型為前脂肪細(xì)胞。前脂肪細(xì)胞是一類具有增殖和脂肪細(xì)胞定向分化能力的特異化前體細(xì)胞[21]。本研究采用小鼠的前體脂肪細(xì)胞系3T3-L1，該細(xì)胞系可以連續(xù)傳代，并且在適當(dāng)條件下可以誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞，其生物學(xué)性能和形態(tài)都與體內(nèi)脂肪細(xì)胞相似，是研究動(dòng)物脂肪形成的理想模型[22]。研究結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞的分化，基因表達(dá)量極顯著升高，說明OLR1基因?qū)η爸炯?xì)胞的成脂分化具有促進(jìn)作用。

對(duì)小鼠OLR1基因分子生物學(xué)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OLR1 蛋白存在2 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別為Smc 結(jié)構(gòu)域和CLECT 結(jié)構(gòu)域。Smc 家族與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂等功能相關(guān)[23]，推測(cè)OLR1基因可能通過該區(qū)域影響前脂肪細(xì)胞的周期，進(jìn)而影響前脂肪細(xì)胞的增殖和凋亡。CLECT 結(jié)構(gòu)域在不同物種中高度保守，它是OLR1 配體識(shí)別的區(qū)域，對(duì)配體的結(jié)合發(fā)揮著重要作用[24]，推測(cè)OLR1基因可能通過該區(qū)域識(shí)別脂肪沉積相關(guān)的配體，進(jìn)而影響脂肪代謝。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)揭示了OLR1基因在小鼠前脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞分化程度增加，OLR1基因表達(dá)量逐漸升高，說明該基因可以作為影響脂肪發(fā)育的候選基因。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了小鼠OLR1基因過表達(dá)載體，可以轉(zhuǎn)染小鼠的前脂肪細(xì)胞，為研究基因在脂肪細(xì)胞增殖、分化和凋亡中的作用奠定基礎(chǔ)。