秦建民，張來香，魏振英

(1.青島市第八人民醫(yī)院 眼科， 山東 青島 266000； 2.青島市中心醫(yī)院 肝膽血管外科, 山東 青島 266000；3.青島市婦女兒童醫(yī)院 新生兒童重癥監(jiān)護(hù)病房， 山東 青島 266011)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，也是世界范圍內(nèi)致盲的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變患病率為24%～27%，2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變患病率為9%～16%，糖尿病患者失明率為0.2%～0.5%[2]。因此，了解DR發(fā)生的分子機(jī)制，尋找新的治療方法至關(guān)常重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)節(jié)功能的短鏈非編碼RNA，其通過抑制下游靶蛋白表達(dá)來降解mRNA，調(diào)節(jié)蛋白翻譯，參與細(xì)胞的增殖、凋亡等生理和病理過程。目前對(duì)miRNA的研究主要集中在腫瘤中，對(duì)其在其他疾病中的研究較少。miR-193a-3p是一種腫瘤相關(guān)miRNA，miR-193a-3p在食管癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤表達(dá)異常，參與對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及耐藥等的調(diào)控[3-4]。研究顯示高血糖狀態(tài)下仔豬心外膜脂肪組織miR-193a-3p的表達(dá)發(fā)生改變，其表達(dá)異常可能與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生有關(guān)[5]。于是推測miR-193a-3p可能參與人DR進(jìn)展。視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是視網(wǎng)膜病變的早期病理表現(xiàn)之一，因此，本研究采用高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal endothelial cells，HRECs)凋亡構(gòu)建DR細(xì)胞模型[6-7]，研究miR-193a-3p在高糖干預(yù)的HRECs中的變化以及對(duì)HRECs凋亡的影響，以期為DR的治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞HRECs系(美國模式培養(yǎng)物保藏所)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)；抑制物對(duì)照(anti-miR-NC)、miR-193a-3p抑制物(anti-miR-193a-3p)、模擬物對(duì)照(miR-NC)和miR-193a-3p模擬物(miR-193a-3p mimics)(上海吉瑪制藥有限公司)；PI3K/AKT信號(hào)通路阻斷劑LY294002(Sigma-Aldrich公司)；總RNA提取試劑盒和LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物科技公司)；兔源活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase-3，c-caspase-3)抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)抗體以及山羊抗兔Ⅱ抗(Abcam公司)；兔源磷酸化的磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)抗體、兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體、兔源β-actin抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組:用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%條件下培養(yǎng)HRECs，0.25%的胰蛋白酶消化后傳代。分為正常對(duì)照(normal control，NC)組；模型(model)組：用葡萄糖濃度為30 mmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HRECs細(xì)胞48 h；anti-miR-NC組：轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的HRECs；anti-miR-193a-3p組：轉(zhuǎn)染anti-miR-193a-3p的HRECs；模型+miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-NC后進(jìn)行高糖處理；模型+miR-193a-3p組：轉(zhuǎn)染miR-193a-3p mimics后進(jìn)行高糖處理；模型+LY294002組：高糖處理HRECs細(xì)胞后，利用30 μmol/L的LY294002進(jìn)行干擾24 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參考LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-193a-3p的表達(dá)水平:用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定各組樣品中RNA的濃度。以U6為內(nèi)參，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序設(shè)置為：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算各組樣品中miR-193a-3p的表達(dá)水平。引物序列如下：miR-193a-3p上游引物5′-AACTGGCCTACAAAGTCCCAGT-3′，試劑盒通用引物作為下游引物；U6上游引物5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′。

1.2.3 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:PBS洗滌細(xì)胞兩次，胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞沉淀，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×105個(gè)/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，依次加入5 μL的annexin V-FITC和5 μL的PI，于避光條件下結(jié)合15 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測c-caspase-3、Bcl-2、p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平:用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白。取適量細(xì)胞蛋白與上樣緩沖液混合后，沸水浴5 min變性細(xì)胞蛋白，取40 μg蛋白樣品上樣至每個(gè)泳道進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后利用常規(guī)濕法磚模裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后，與稀釋的Ⅰ抗(c-caspase-3和Bcl-2抗體稀釋比例為1∶1 000，β-actin抗體稀釋比例為1∶500)室溫條件反應(yīng)2 h后，與稀釋的Ⅱ抗(1∶1 000)室溫條件下結(jié)合1 h，采用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用Quantity One軟件對(duì)各組細(xì)胞目的蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

為檢測miR-193a-3p是通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)進(jìn)而影響HG誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡，提取細(xì)胞蛋白，按照上述步驟檢測p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平。p-PI3K抗體稀釋比例為1∶1 000，和p-AKT抗體稀釋比例為1∶2 000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-193a-3p的表達(dá)

模型組HRECs細(xì)胞中miR-193a-3p的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 模型組HRECs蛋白表達(dá)及凋亡

模型組HRECs細(xì)胞c-caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖1，表1)。

表1 模型組HRECs蛋白表達(dá)及凋亡

c-caspase-3.cleaved-caspase-3; A.flow cytometry detected cell apoptosis; B.Western blot detected the expression of c-caspase-3 and Bcl-2 protein

2.3 低表達(dá)miR-193a-3p對(duì)HRECs凋亡的影響

與anti-miR-NC組比較，anti-miR-193a-3p組miR-193a-5p的表達(dá)水平顯著降低，c-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)(圖2，表2)。

表2 低表達(dá)miR-193a-3p對(duì)HRECs凋亡的影響

c-caspase-3.cleaved-caspase-3

2.4 Western blot檢測PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白

模型組同對(duì)照組相比PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K和p-AKT的表達(dá)顯著升高，anti-miR-193a-3p組同anti-miR-NC組相比PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K和p-AKT的表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with NC; #P<0.05 compared with anti-miR-NC

2.5 高表達(dá)miR-193a-3p可以減輕高糖處理對(duì)HRECs凋亡的影響

模型+miR-193a-3p組同模型+miR-NC組比較HRECs細(xì)胞miR-193a-3p的表達(dá)水平顯著升高，c-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖4，表3)。

c-caspase-3.cleaved-caspase-3

表3 高表達(dá)miR-193a-3p可以減輕高糖處理對(duì)HRECs凋亡的影響

2.6 抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可減輕高糖處理對(duì)HRECs凋亡的影響

模型+LY294002組同模型組比較HRECs細(xì)胞p-PI3K、p-AKT和c-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖5，表4)。

表4 Western blot檢測PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白

c-caspase-3.cleaved-caspase-3

3 討論

DR是一種常見的糖尿病微血管并發(fā)癥， 可導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管進(jìn)行性損害，嚴(yán)重影響患者的身心健康，給社會(huì)帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，盡管醫(yī)學(xué)研究不斷進(jìn)展，但DR治療效果仍不能能令人滿意[8]。因此，闡明DR進(jìn)展的分子機(jī)制，開辟新的治療途徑迫在眉睫。

miRNAs參與細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理和病理過程。隨著對(duì)miRNAs和DR的相關(guān)研究的不斷深入，多種miRNAs相繼被發(fā)現(xiàn)。研究顯示miR-200b通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)變生長因子β1表達(dá)，調(diào)節(jié)HRECs增殖，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展[9]。血紅素氧合酶1對(duì)DR中hRECs具有保護(hù)作用，miR-214和miR-181b是HO-1發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)[10]。miR-21-5p在高糖誘導(dǎo)的HRECs中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-21-5p通過調(diào)控PI3K/AKT和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路活性抑制HRECs的血管生成[11]。miR-193a-3p被認(rèn)為參與調(diào)控糖尿病發(fā)生發(fā)展[5]，但其在DR中的作用尚未闡明。本研究顯示高糖誘導(dǎo)后HRECs中miR-193a-3p的表達(dá)水平顯著降低，c-caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡率增加。轉(zhuǎn)染anti-miR-193a-3p低表達(dá)miR-193a-3p可促進(jìn)c-caspase-3表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)HRECs凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-193a-3p可抑制c-caspase-3表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，逆轉(zhuǎn)高糖處理對(duì)HRECs細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。提示miR-193a-3p的表達(dá)降低與高糖誘導(dǎo)的HRECs凋亡有關(guān)。

PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控血糖的主要信號(hào)途徑，其異常影響相應(yīng)組織器官細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、血管生成等多個(gè)細(xì)胞過程，導(dǎo)致疾病發(fā)生[12]。高糖通過激活猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)血管新生，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可阻斷高糖對(duì)血管新生的促進(jìn)作用[13]。miR-126通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)HRECs增殖，增加細(xì)胞存活率，抑制高糖誘導(dǎo)的HRECs凋亡，是DR治療的潛在靶點(diǎn)[14]。本研究顯示高糖誘導(dǎo)后HRECs中p-PI3K和p-AKT的磷酸化水平顯著增加，PI3K/Akt信號(hào)通路激活。miR-193a-3p低表達(dá)促進(jìn)PI3K-Akt信號(hào)通路活化。阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路抑制c-caspase-3表達(dá)， 促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，減緩高糖誘導(dǎo)的HRECs凋亡。提示miR-193a-3p可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的HRECs凋亡。

綜上所述，miR-193a-3p可抑制高糖誘導(dǎo)的HRECs凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。因此，miR-193a-3p有望成為DR的潛在治療靶點(diǎn)，為DR臨床治療提供了新的方向。