李春杰，郎鳴曉，陳振江，王正鳳，陳泰祥

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心，蘭州大學(xué)甘肅省西部草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州大學(xué)草地微生物研究中心，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020）

禾草內(nèi)生真菌（grass fungal endophyte）是指在宿主禾草中度過(guò)部分或全部生命周期，而對(duì)禾草本身不引起任何外部癥狀的一類真菌［1］?，F(xiàn)在研究較多的禾草內(nèi)生真菌是子囊菌門(mén)（Asomycota）麥角菌科（Clavicipitaceae）的有性世代Epichlo?屬內(nèi)生真菌及其所對(duì)應(yīng)無(wú)性世代Neotyphodium屬，2014 年，Leuchtmann 等［2］將這兩種屬的內(nèi)生真菌統(tǒng)一歸總為Epichlo?屬。目前，在全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)80 個(gè)屬300 多種禾草中存在有內(nèi)生真菌［3?4］。一方面，禾草內(nèi)生真菌共生體能夠產(chǎn)生對(duì)家畜有毒的生物堿，給畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大阻礙和經(jīng)濟(jì)損失；但另一方面，禾草內(nèi)生真菌共生對(duì)宿主和內(nèi)生真菌皆有利：內(nèi)生真菌從宿主植物體內(nèi)獲取自身所需營(yíng)養(yǎng)、進(jìn)行繁殖，并通過(guò)宿主植物傳播，而內(nèi)生真菌往往能夠提高宿主植物對(duì)干旱［5］、鹽堿［6］、重金屬［7］、寒冷［8］和水澇［9］等非生物脅迫的耐受性和抵抗昆蟲(chóng)［10］、病原菌［11?13］、線蟲(chóng)［14］等生物脅迫的能力，部分內(nèi)生真菌還能夠用于生物防治［15］、生成生長(zhǎng)激素，以促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)和發(fā)育［16］，提高植物的競(jìng)爭(zhēng)能力［17］和維持生態(tài)系統(tǒng)平衡［18］；同時(shí)，共生體產(chǎn)生的有毒生物堿能夠使家畜中毒，在一定程度上能夠減少草食動(dòng)物的采食進(jìn)而保護(hù)禾草［19］。內(nèi)生真菌在植物中分布十分廣泛，其宿主植物包括草本、灌木、喬木及藻類等，尤其在禾本科植物中分布最多［20］。內(nèi)生真菌在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上都有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用潛力［21］，然而，自然界中大多數(shù)禾草只能被一種內(nèi)生真菌所侵染，僅有一小部分內(nèi)生真菌可與多個(gè)宿主共生或宿主可與多種內(nèi)生真菌共生［22］。研究發(fā)現(xiàn)，同一種內(nèi)生真菌與同種宿主的不同品種共生，其對(duì)兩個(gè)不同品種宿主植物的影響有差異［23］（表1）。同時(shí)，野生禾草相較于被馴化的禾草，其內(nèi)生真菌的侵染與定殖不穩(wěn)定，受生長(zhǎng)環(huán)境、宿主特性、生長(zhǎng)年限等因素影響［24?26］，這都使得禾草?內(nèi)生真菌共生體優(yōu)良性狀的應(yīng)用與推廣受到限制。由于禾本科植物內(nèi)生真菌的宿主特異性，以及人工接種過(guò)程操作要求高，同時(shí)還需破壞植物組織而導(dǎo)致宿主死亡率高，使得人工接種成功率較低。1985 年Latch 等［27］用無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接法成功接種禾草，研究不同宿主與不同內(nèi)生真菌種類組合以及不同接種方法等因素對(duì)接種成功率的綜合影響，使禾草內(nèi)生真菌人工接種方法逐步建立起來(lái)。

表1 不同禾草-內(nèi)生真菌組合人工接種結(jié)果Table 1 Artificial inoculation results of different grass-endophytic fungi combinations

禾草內(nèi)生真菌人工接種最常見(jiàn)的方法是切口法和注射法，但這兩種方法的缺點(diǎn)是可對(duì)禾草植株造成一定的物理傷害而導(dǎo)致植株尤其是幼苗死亡率高。種子浸菌法和種子傷口法需要在種子上造成一定的創(chuàng)口，再將菌懸液或菌絲接入創(chuàng)口內(nèi)，兩種接種方法更適用于接種無(wú)性繁殖的內(nèi)生真菌。愈傷組織接種法可供選擇的外植體較多：莖節(jié)、花穗、花序、幼穗、未成熟胚及成熟種子均可作為材料［28?30］，但該技術(shù)的缺點(diǎn)是在禾本科植物上應(yīng)用相對(duì)困難，一是因?yàn)楹瘫究浦参锏慕M織培養(yǎng)再生對(duì)基因型有較強(qiáng)的依賴，其胚性愈傷組織再生率低；二是禾本科植物組織培養(yǎng)再生體系不夠完善，成熟的組織培養(yǎng)再生體系并不一定適用于禾本科植物；三是禾本科植物組培常用成熟種子（胚）作為外植體，其誘導(dǎo)的胚性愈傷組織比例低，且需要繼代培養(yǎng)，所需周期長(zhǎng)，又會(huì)使愈傷組織分化率降低［31］。在禾草組織培養(yǎng)再生體系全面建立的前提下，愈傷組織接種法的潛在成功率相對(duì)較高。成株接種法適用于已經(jīng)生長(zhǎng)健壯的成株植物，健壯植株的抵抗力較好，對(duì)其造成物理傷害不易死亡，但缺點(diǎn)是由于成株具有較強(qiáng)抵抗外來(lái)真菌的能力而使該方法接種成功率較低（表2）。

表2 不同接種方法操作步驟及接種成功率Table 2 Different inoculation methods and inoculation rate

續(xù)表1 Continued Table 1

本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外禾草內(nèi)生真菌人工接種方法進(jìn)行綜述，為建立創(chuàng)新人工接種技術(shù)，選擇合適的接種手段，充分利用內(nèi)生真菌資源，構(gòu)建優(yōu)良禾草內(nèi)生真菌共生體，以消除自然界內(nèi)共生體的局限性，擴(kuò)大內(nèi)生真菌在禾草中的共生范圍，為創(chuàng)制新的禾草內(nèi)生真菌共生體種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 無(wú)菌苗接種法

禾草內(nèi)生真菌人工接種方法研究初期，多以無(wú)菌苗為試驗(yàn)材料，主要有兩種接種方法：將菌絲體置于無(wú)菌苗特定部位和傷口部位進(jìn)行培養(yǎng)，其傷口部位多在無(wú)菌苗胚芽鞘和中胚軸之間。傷口接種法是事先在無(wú)菌苗特定部位切開(kāi)傷口，將培養(yǎng)好的真菌菌絲放入其中，于適宜條件下培養(yǎng)幼苗。研究發(fā)現(xiàn)，將菌絲接入無(wú)菌苗傷口的接種效果遠(yuǎn)好于直接將菌絲體放在無(wú)菌苗組織上［27］。最早國(guó)際知名的內(nèi)生真菌學(xué)專家Latch 等［27］以多年生黑麥草（L. perenne）、高羊茅（F. arundinacea）和紫羊茅（F. rubra）為研究對(duì)象，從無(wú)內(nèi)生真菌共生的植物中獲取不帶內(nèi)生真菌的種子，消毒后在無(wú)菌條件下培養(yǎng)得到無(wú)菌苗，將培養(yǎng)得到的真菌菌絲體用以下3 種方法接入幼苗：1）直接在無(wú)菌苗中胚軸及胚芽鞘交界處放置菌絲體；2）在無(wú)菌苗中胚軸及胚芽鞘交界處切一個(gè)3～5 mm 的縱向切口，并取出切口植物組織，將菌絲體放入；3）在無(wú)菌苗中胚軸及胚芽鞘交界處切一個(gè)3～5 mm 的縱向切口，將菌絲體直接接入。經(jīng)檢測(cè)，該試驗(yàn)總的接種成功率為10.8%，對(duì)植物不同的處理方式也直接影響到幼苗接種成功率。我國(guó)第一次采用幼苗切口法將內(nèi)生真菌接入高羊茅和多年生黑麥草，得到成功接種的禾草內(nèi)生真菌共生體，但其接種率較低，不同組合的接種效率分別為0.94%和1.00%［21］。將Epichlo?屬內(nèi)生真菌參考Latch 等［27］的方法導(dǎo)入小麥（T. aestivum）、大麥（H. vulgare）和黑麥（Secale cereale）中，結(jié)果僅在黑麥和小麥接種成功，但發(fā)現(xiàn)感染了內(nèi)生真菌的植株出現(xiàn)了發(fā)育不良或矮化的癥狀［23］，由此可見(jiàn)內(nèi)生真菌對(duì)親緣關(guān)系不同的宿主植物有不同的影響。2015 年，陳麗［32］將甘肅內(nèi)生真菌（E. gansuensis）用無(wú)菌苗接種法接入醉馬草（A. inebrians）無(wú)菌苗中，獲得了比較高的接種率，為21%。王正鳳［33］將E. bromicola內(nèi)生真菌接入大麥無(wú)菌苗中，得到侵染率為2%的新共生體，這是國(guó)內(nèi)首次將禾草內(nèi)生真菌接入作物大麥中，為今后禾谷類作物的種質(zhì)創(chuàng)新提供新的研究方向。無(wú)菌苗傷口接種法操作簡(jiǎn)單，但此方法的缺點(diǎn)是對(duì)幼苗產(chǎn)生的物理傷害往往會(huì)造成幼苗高死亡率，且不適用于相對(duì)細(xì)弱的幼苗和成熟組織。總之，無(wú)菌苗接種法仍是目前應(yīng)用最為普遍的接種方法。

2 注射接種法

注射法常以幼苗為對(duì)象，取內(nèi)生真菌菌絲制成菌懸液或直接將菌絲隨無(wú)菌水一同注入幼苗內(nèi)以侵染植株，其注射部位通常為幼苗莖基部分生區(qū)［34］和幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)［35］。將扁芒草屬（Danthoniasp.）、針茅屬（Stipasp.）和洋狗尾草屬（Cynosurussp.）種子消毒后在無(wú)菌條件下培育成幼苗，待幼苗培育好后，用無(wú)菌注射器將菌絲體或分生孢子隨無(wú)菌水注入幼苗分生組織上方中，經(jīng)檢測(cè)，接種成功率為0～100%。該試驗(yàn)接種成功率差異較大，其結(jié)果與宿主及內(nèi)生真菌是否兼容有極大關(guān)聯(lián)，同時(shí)，接種成功率與接種時(shí)幼苗的年齡密切相關(guān)，且接種后菌絲的定殖環(huán)境對(duì)接種成功率也有影響［36］。用從羊茅中分離出的E. typhina內(nèi)生真菌制成菌懸液注射侵染5 種高羊茅商業(yè)品種，得到總接種成功率為2.5%［35］。注射法的缺點(diǎn)是其操作過(guò)程較為繁瑣，接種過(guò)程中技術(shù)要求和環(huán)境條件較高，但通過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)注射法相較于種子浸菌法侵染率更高［35］。建議在進(jìn)行無(wú)菌苗接種法和注射接種法之前做足夠的預(yù)試驗(yàn)，待充分掌握此兩種技術(shù)后再進(jìn)行后續(xù)大量接種。

3 種子接種法

3.1 種子浸菌法

Epichlo?內(nèi)生真菌菌絲在宿主植物中的侵染過(guò)程為先侵入芽原基，而后侵入花原基，并隨著花原基發(fā)育為小花最后侵染進(jìn)入種子，并通過(guò)種子進(jìn)行垂直傳播［33］。因此，Epichlo?內(nèi)生真菌可通過(guò)菌絲接種于種子進(jìn)行侵染。將不含內(nèi)生真菌的高羊茅種子消毒處理后剪破，置于含有菌懸液的培養(yǎng)皿或錐形瓶中封口培養(yǎng)，并按時(shí)澆灌菌懸液，其接種成功率為2.1%。注射法和種子浸菌法都是將菌懸液導(dǎo)入植株體內(nèi)［35］，與注射法相比，種子浸菌法操作簡(jiǎn)便，但該方法的缺點(diǎn)是需要破壞種子，雖利于菌絲侵入，卻同時(shí)破壞了種子結(jié)構(gòu)，影響了種子正常生長(zhǎng)發(fā)育，降低了種子的存活率，進(jìn)而導(dǎo)致菌絲體在種子發(fā)芽生長(zhǎng)過(guò)程中難以進(jìn)入幼苗而繼續(xù)正常生長(zhǎng)。

3.2 種子傷口法

種子傷口法是直接使菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)種子傷口的方法。通過(guò)嘗試試驗(yàn)，在消毒后的多年生黑麥草、高羊茅和冰草（Agropyron cristatum）種子胚部剪一小口，將內(nèi)生真菌菌絲接入傷口，最終種子成活率低且成活的接種苗均未被感染［21］。發(fā)明專利表明，用無(wú)菌的接種針刺穿消過(guò)毒的種子，將刺穿的種子放在有內(nèi)生真菌菌落的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)［37］。種子接種法的優(yōu)點(diǎn)是其接種周期短，且操作要求較低［37］，但缺點(diǎn)在于該方法是一種新的人工接種技術(shù)的嘗試，目前接種成功率并不高，需要在接下來(lái)的試驗(yàn)中探索該方法的可行性。在要求高接種成功率的同時(shí)，還要保證種子發(fā)芽率和幼苗成活率。

4 愈傷組織接種法

組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌環(huán)境中，以植物組織為材料進(jìn)行人工培養(yǎng)，獲得再生完整植株的技術(shù)，是利用愈傷組織人工接種法培育禾草內(nèi)生真菌共生體的首要條件［21］。胚和幼苗是植物生命周期中內(nèi)生真菌自然侵入的唯一階段，因此，許多學(xué)者試圖在體外模擬這一過(guò)程［38］。愈傷組織接種法需要經(jīng)過(guò)愈傷組織的誘導(dǎo)、分化、生根和再生等過(guò)程，其中，誘導(dǎo)和分化是關(guān)鍵步驟，且愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率與外植體類型、植物基因型、培養(yǎng)基種類以及培養(yǎng)基中激素濃度及比例有關(guān)［39］，不同的外植體最佳激素濃度不同，以幼穗和未成熟胚為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織分化率高于莖和花序，且出愈率高于成熟種子，但其取材易受時(shí)空條件限制，而由成熟種子為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織植物再生頻率高且取材方便，因此成為誘導(dǎo)愈傷組織的理想材料［30］。Johnson 等［40］研究發(fā)現(xiàn)，將E.coenophiala接入高羊茅由花梗誘導(dǎo)出的愈傷組織中，最終得到侵染成功率為17%的高羊茅內(nèi)生真菌共生體，同時(shí)在新的共生體中檢測(cè)到了生物堿的積累。用E. coenophiala侵染高羊茅，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌接種在體細(xì)胞胚上得到最高的侵染率為5%［38］。國(guó)內(nèi)首次將E. typhina、E. coenophiala和Epochlo?sp. 內(nèi)生真菌接入由禾本科植物：多年生黑麥草、高羊茅和翦股穎（Agrostis stolonifera）的種子和胚為外植體所誘導(dǎo)的愈傷組織中。當(dāng)愈傷組織上出現(xiàn)黃綠色幼芽，將內(nèi)生真菌菌絲制成的孢子懸液接入分化芽切口，再進(jìn)行培養(yǎng)得到共生體，不同組合的接種效率分別為3.6%、3.6%和7.9%，并通過(guò)分離培養(yǎng)驗(yàn)證得到了新的多年生黑麥草?E. typhina共生體［21］。與無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接法相比，愈傷組織法的缺點(diǎn)在于操作更為繁瑣，周期長(zhǎng)且制作成本高。但該方法的優(yōu)點(diǎn)是不受季節(jié)和地理位置的限制［41］，有研究者通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比愈傷組織和傷口法的接種成功率，發(fā)現(xiàn)愈傷組織法接種的幼苗更易受到內(nèi)生真菌的侵染［21］，且選用成熟胚作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果好于種子［42?43］。提高愈傷組織接種的成功率，要提高愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，在操作過(guò)程中減少愈傷組織的感染，優(yōu)化再生植株的生長(zhǎng)條件［21］（表3）。

表3 不同植物及外植體誘導(dǎo)愈傷組織所需激素濃度Table 3 Hormone concentration required for callus induction in different plant species and explants

5 成株接種法

成株接種法是將菌絲體或菌懸液直接塞入或注入事先在成株基部切好的傷口中進(jìn)行培養(yǎng)。研究者將內(nèi)生真菌菌絲接入或注射于黑麥草成熟分蘗基部［27］，以及將菌絲塞入事先在生長(zhǎng)健壯的成株高羊茅基部劃開(kāi)的傷口中進(jìn)行培養(yǎng)［35］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩項(xiàng)試驗(yàn)均未獲得成功感染的植株。該方法在使用時(shí)需要選取健壯的禾草植株，且在基部的傷口不可過(guò)深，在試驗(yàn)過(guò)程中注意保持植株的直立狀態(tài)，避免其出現(xiàn)倒伏。南開(kāi)大學(xué)高玉葆課題組用成株分蘗轉(zhuǎn)接法接種高羊茅，得到接種成功率為3%的高羊茅內(nèi)生真菌共生體［33］。成株接種法缺點(diǎn)在于成熟植株傷口較大，病菌容易侵入而影響植株的正常生長(zhǎng)，而且健壯的植株自身具備抵御外源菌侵入的能力，塞入切口中的菌絲體很難定殖［35］，但相較于無(wú)菌苗接種法，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可應(yīng)用于成熟的禾草植株，且接種條件要求較低。

6 展望

我國(guó)幅員遼闊，地大物博，有著豐富的植物物種資源，其中包括超過(guò)225 個(gè)屬近1200 個(gè)種的禾本科植物［50］，且目前已在全世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)至少80 個(gè)屬300 余種禾本科植物帶有內(nèi)生真菌［33］，在我國(guó)，早熟禾屬（Poa）、羊茅屬、披堿草屬（Elymus）等21 屬77 種禾草植物中發(fā)現(xiàn)Epichlo?內(nèi)生真菌［51］。研究發(fā)現(xiàn)，禾草與內(nèi)生真菌共生能夠在其品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性等方面發(fā)揮積極作用，因此，利用內(nèi)生真菌對(duì)禾草進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新是近年來(lái)國(guó)際草業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)［52］。關(guān)于內(nèi)生真菌對(duì)寄主禾草的生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)及抗逆性影響的研究很多，但由于內(nèi)生真菌的宿主特異性，其對(duì)宿主的良性影響并不能在多種禾草上體現(xiàn)，新西蘭學(xué)者嘗試用人工接種技術(shù)將從小麥族植物分離出的內(nèi)生真菌接入小麥、大麥和黑麥等麥類作物中，發(fā)現(xiàn)不同宿主基因型對(duì)內(nèi)生真菌侵染的效應(yīng)存在差異［23］。內(nèi)生真菌具有雙重特性，通過(guò)在內(nèi)生真菌菌種資源中篩選對(duì)家畜不產(chǎn)生有毒物質(zhì)及提高宿主抗性等具有優(yōu)良特性的菌株，并利用人工接種技術(shù)建立新的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗逆無(wú)毒的禾草?內(nèi)生真菌共生體，在提高禾草產(chǎn)量、品質(zhì)、確保人類及家畜食用安全性方面有重要意義［53］。

在國(guó)際學(xué)術(shù)界，關(guān)于禾草內(nèi)生真菌人工接種技術(shù)的研究并不多，且成功的人工接種技術(shù)受專利保護(hù)［52］。而關(guān)于內(nèi)生真菌與非禾本科植物的接種技術(shù)及禾草與病原菌［54?55］、菌根真菌［56?57］的接種技術(shù)研究較多，但這兩方面的接種技術(shù)并不完全適用于共生真菌接種禾本科植物。在許多研究中，用不同內(nèi)生真菌接種禾草，禾草未必能夠被所有真菌侵染，這不僅僅是由于宿主特異性的影響，在接種方式的選擇、宿主植物基因型、內(nèi)生真菌基因型、植物組織類型、宿主處理方式及后續(xù)培養(yǎng)條件等方面對(duì)接種成功率都有極大的影響。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)禾草的人工接種方法，主要是以無(wú)菌苗、愈傷組織、種子及成株為材料的方式。無(wú)菌苗接種法和注射接種法在目前研究中廣泛使用，其操作簡(jiǎn)便高效，適用于大批量接種，但其缺點(diǎn)在于操作過(guò)程需對(duì)幼苗造成傷口，易被其他病原菌感染，且幼苗較弱易死亡；愈傷組織接種法優(yōu)點(diǎn)在于成功率相對(duì)較高，而缺點(diǎn)是需建立成熟的組織培養(yǎng)再生體系，目前只有少數(shù)禾草建立起完整的組織培養(yǎng)再生體系，故該方法的應(yīng)用具有較大局限性；以種子為材料進(jìn)行的人工接種方法如種子傷口法和種子浸菌法，是基于內(nèi)生真菌能夠通過(guò)垂直傳播直接進(jìn)入植物地上部，因而是人工接種技術(shù)創(chuàng)新的一個(gè)重要方向；種子浸菌法優(yōu)點(diǎn)是在內(nèi)生細(xì)菌、病原菌、內(nèi)生真菌接種方面都有很好的應(yīng)用，且其宿主植物不局限于禾草，但該方法的缺點(diǎn)是接種過(guò)程中可能由于破壞種子結(jié)構(gòu)而造成種子失活，同時(shí)其侵染率往往低于無(wú)菌苗接種法，故此方法在試驗(yàn)研究中應(yīng)用較多，而實(shí)際生產(chǎn)操作中推廣不足；以成株為材料的接種方法和種子接種法目前在試驗(yàn)階段，接種成功率尚且不高，在實(shí)際操作中并未廣泛使用。學(xué)者們提出并嘗試了愈傷組織與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)的接種新方法，在不傷害植物組織的前提下，使內(nèi)生真菌與植物自然共生，但尚未成功，方法還正在優(yōu)化中。

針對(duì)人工接種技術(shù)對(duì)試驗(yàn)材料的破壞及在培養(yǎng)過(guò)程中易受到雜菌污染導(dǎo)致接種成功率低等問(wèn)題，應(yīng)當(dāng)通過(guò)大量試驗(yàn)操作，對(duì)不同禾草品種建立起最適接種條件和接種操作要求，在保證接種成功率的同時(shí)要盡量簡(jiǎn)化接種步驟，以便進(jìn)一步在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。對(duì)于尚在試驗(yàn)階段的人工接種技術(shù)，應(yīng)當(dāng)分析試驗(yàn)材料生理特點(diǎn)與試驗(yàn)操作技術(shù)在科學(xué)性和操作性方面是否切實(shí)可行。近年來(lái)，分子生物技術(shù)和基因組學(xué)研究發(fā)展迅速，對(duì)內(nèi)生真菌的系統(tǒng)研究也有了很大的促進(jìn)作用。新一代測(cè)序技術(shù)，如全基因組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)內(nèi)生真菌生物堿合成相關(guān)基因的探索分析，為了解寄主與真菌相互作用的基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)［58］。美國(guó)肯塔基大學(xué)Christopher Schardl 教授和澳大利亞維多利亞農(nóng)業(yè)生物研究中心German Spangenberg 教授在實(shí)驗(yàn)室相繼完成了對(duì)不同禾草內(nèi)生真菌的全基因組測(cè)序，使全球的科學(xué)家能夠共同探索影響真菌與宿主關(guān)系的相關(guān)基因［59?61］。因此，應(yīng)進(jìn)一步借助分子生物學(xué)手段解決內(nèi)生真菌與宿主的遺傳穩(wěn)定性和相容性差的問(wèn)題，為禾草內(nèi)生真菌共生體的研究提供更多理論支持?？傊?，不同領(lǐng)域的研究與技術(shù)相互融合，更加系統(tǒng)和完善的新技術(shù)與新發(fā)現(xiàn)都將應(yīng)用于禾草內(nèi)生真菌人工接種技術(shù)中，為創(chuàng)建新的禾草內(nèi)生真菌共生體提供理論依據(jù)。

隨著禾草內(nèi)生真菌共生體建立與功能等領(lǐng)域研究的不斷深入，接種的內(nèi)生真菌在禾草子代中穩(wěn)定遺傳成為一大研究趨勢(shì)。結(jié)合現(xiàn)有接種和生物工程技術(shù)，建立能在禾本科植物中穩(wěn)定遺傳的禾草內(nèi)生真菌共生體的人工接種方法勢(shì)在必行。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌基因組中帶有能使家畜等其他動(dòng)物中毒的基因，這為禾草內(nèi)生真菌新共生體的建立帶來(lái)新的問(wèn)題，新共生體的建立不應(yīng)只局限于高接種成功率這層次，應(yīng)當(dāng)深入到內(nèi)生真菌產(chǎn)堿基因中，研究產(chǎn)堿基因的表達(dá)及調(diào)控機(jī)理，分析其對(duì)家畜、生態(tài)環(huán)境甚至人類的潛在危險(xiǎn)，并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期獲得最有利于人類及生態(tài)環(huán)境的真菌與植物資源?，F(xiàn)有的內(nèi)生真菌接種方法只能針對(duì)內(nèi)生真菌對(duì)宿主是否能夠侵染及兼容，并不能準(zhǔn)確判斷內(nèi)生真菌對(duì)宿主的影響。目前，新接種方法研究的不斷發(fā)展為禾草內(nèi)生真菌人工接種技術(shù)提供了更多啟示。因此，應(yīng)結(jié)合傳統(tǒng)與新開(kāi)發(fā)的人工接種技術(shù)，針對(duì)禾草植株的外部形態(tài)、物種特異性、受體組織類型及其生長(zhǎng)狀態(tài)，建立適用于不同禾草和內(nèi)生真菌的技術(shù)手段進(jìn)行人工接種，這樣才能更好更快地建立目標(biāo)共生體，創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)，培育抗逆的優(yōu)良品種。