AL-ADEEB Abdulqader,喬郅鈉,徐美娟,楊套偉,張顯,邵明龍,饒志明

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

α-酮異己酸是亮氨酸的無(wú)氮替代物,可作為慢性腎臟疾病和乙型肝炎病毒感染治療的組成部分,為患者提供每日所需的L-亮氨酸[1],具有促進(jìn)胰島素分泌[2-3],抑制胰高血糖素分泌[4-5],減少體內(nèi)氮消耗,促進(jìn)肌肉合成[6-7],降低肌肉分解的作用[8-9],在食品、醫(yī)藥、飼料等方面應(yīng)用廣泛[10]。

α-酮異己酸最常用的生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法,包括用二乙基草酰胺與格氏試劑加成產(chǎn)物的水解反應(yīng)、雙羰基化法和海因法等[11]。這些方法均需高成本的催化劑或特殊的起始結(jié)構(gòu),使得α-酮異己酸的生產(chǎn)成本較高。其次,還需使用有毒反應(yīng)物,對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。目前,生物法合成α-酮異己酸的研究越來(lái)越多,主要是發(fā)酵法和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法[12]。BüCKLE-VALLANT等[13]通過(guò)代謝工程改造谷氨酸棒桿菌實(shí)現(xiàn)了α-酮異己酸的直接發(fā)酵生產(chǎn),但產(chǎn)量低(9.23 g/L),還存在副產(chǎn)物α-酮異戊酸及氨基酸缺陷型問(wèn)題。為解決氨基酸缺陷型問(wèn)題,改變了轉(zhuǎn)氨酶B編碼基因ilvE的起始密碼子并將不同拷貝的基因整合到基因組上,α-酮異己酸含量達(dá)到6.1 g/L,但這種方法并沒(méi)有完全解決氨基酸缺陷問(wèn)題,且發(fā)酵過(guò)程仍需添加多種昂貴的氨基酸,副產(chǎn)物也較多[14],由此可見(jiàn),基于代謝工程的α-酮異己酸合成方法存在產(chǎn)量低、副產(chǎn)物多,且需要添加多種昂貴氨基酸,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法由于副產(chǎn)物少、操作簡(jiǎn)單、合成步驟少,而且反應(yīng)過(guò)程中,無(wú)需添加有毒化學(xué)原料,產(chǎn)品純度高,易于分離純化,更適合工業(yè)化生產(chǎn)。普通變形桿菌Proteusvulgaris來(lái)源的膜結(jié)合型L-氨基酸脫氨酶(L-amino acid deaminase,L-AAD)能夠催化L-亮氨酸脫氨基生成α-酮異己酸而不產(chǎn)生H2O2,從而減少對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[15-16],已被廣泛應(yīng)用于各種α-酮酸的合成,如苯丙酮酸[17]、α-酮異戊酸[18]、α-酮戊二酸[19-20]、α-酮基-γ-甲基硫代丁酸[21]和α-酮異己酸[22]。圖1所示為P.vulgaris來(lái)源的L-AAD脫氨基反應(yīng)過(guò)程中的元素以及α-酮異己酸和L-亮氨酸之間化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。

圖1 P.vulgaris 來(lái)源的L-AAD的脫氨基反應(yīng)

目前,ZHU等[23]利用不透明紅球菌 DSM 43250進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成產(chǎn)量達(dá)1.27 g/L的α-酮異己酸。SONG等[24]將P.vulgaris來(lái)源的L-AAD在大腸桿菌異源表達(dá),以構(gòu)建的重組菌的菌體作為全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化L-亮氨酸獲得69.1 g/L的α-酮異己酸。之后,通過(guò)使用不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒、調(diào)節(jié)起始密碼子下游的mRNA組成、設(shè)計(jì)核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列這3種策略實(shí)現(xiàn)了α-酮異己酸的更高產(chǎn),產(chǎn)量達(dá)到86.55 g/L[25]。

雖然,在大腸桿菌中α-酮異己酸產(chǎn)量已達(dá)到較高水平,但大腸桿菌可能會(huì)將不符合食品衛(wèi)生要求的有害物質(zhì)帶入產(chǎn)品中,因此,需構(gòu)建背景清晰的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng),以實(shí)現(xiàn)α-酮異己酸的安全生產(chǎn)。枯草芽孢桿菌是非致病性細(xì)菌,被美國(guó)食品藥物管理局普遍認(rèn)為是GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株。此外,目前還沒(méi)有P.vulgaris來(lái)源的L-AAD在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)以合成α-酮異己酸的相關(guān)研究報(bào)道。因此,本研究選用食品安全性菌株Bacillussubtilis168作為宿主細(xì)胞,異源表達(dá)了P.vulgaris來(lái)源的L-AAD,構(gòu)建了重組菌株B.subtilis168/pMA5-lad。之后,針對(duì)全細(xì)胞生物合成α-酮異己酸的催化體系進(jìn)行優(yōu)化,并將固定化細(xì)胞技術(shù)用于α-酮異己酸的生物合成,實(shí)現(xiàn)了以L-亮氨酸為底物一步法生物合成α-酮異己酸,為α-酮異己酸及其他重要α-酮酸的工業(yè)化安全合成提供了一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中所用到的質(zhì)粒pMA5、菌株EscherichiacoliJM109、Bacillussubtilis168均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。pUC57-lad質(zhì)粒為蘇州金唯智生物科技有限公司人工合成。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

BamH I、MluI限制性快切酶、10 000 bp核酸marker和蛋白Marker,大連寶生物公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司；α-酮異己酸標(biāo)品,Sigma公司;L-亮氨酸、海藻酸鈉、CaCl2及培養(yǎng)基原料,國(guó)藥。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%和氯化鈉 1%,固體培養(yǎng)基則加1.5%～2.0%的瓊脂粉,根據(jù)需要加入相應(yīng)濃度抗生素。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、K2HPO40.23%、KH2PO40.17、MgSO40.075%、NaCl 0.5%,pH 6.8～7.0,根據(jù)需要加入相應(yīng)濃度抗生素。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨1%、玉米漿0.5%、檸檬酸銨0.3%、葡萄糖4%、K2HPO40.23%、KH2PO40.17%、MgSO40.075%、NaCl 0.5%,pH 6.8～7.0,根據(jù)需要加入相應(yīng)濃度抗生素。

注：培養(yǎng)基配方中的“%”均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌株B.subtilis168/pMA5-lad的構(gòu)建

將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到的P.vulgaris來(lái)源的L-氨基酸脫氨酶編碼基因lad(GeneBank登錄號(hào)：AB030003.1)序列提交至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行合成,并進(jìn)行密碼子優(yōu)化,以利于其在B.subtilis168的異源表達(dá)。

以公司提供的pUC57-lad重組質(zhì)粒為模板,以lad-F：gtgaaatcagggggatccatggccattagccgccgc(BamH I)和lad-R：tcgacctctagaacgcgtttaaaaacgatataaagaaaacggct-tcggg(MluI)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物純化后與經(jīng)BamH I和MluI雙酶切線性化的pMA5質(zhì)粒進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞,涂布含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)8～12 h。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pMA5-lad。

將重組質(zhì)粒pMA5-lad轉(zhuǎn)化B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞,涂布至含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上,于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)8～12 h。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的重組菌株命名為B.subtilis168/pMA5-lad。

1.2.2L-AAD的表達(dá)

首先,將凍管保存的B.subtilis168/pMA5-lad重組菌株在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線活化,挑取單菌落轉(zhuǎn)接10 mL 50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)8～12 h后,按10%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接50 mL含相同濃度的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)24 h,以誘導(dǎo)L-AAD的表達(dá)。之后,在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,細(xì)胞菌體用5 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)洗2次。最后,將細(xì)胞菌體懸浮于5 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中并用超聲破碎儀進(jìn)行破碎,破碎液在4 ℃下離心20 min,收集上清液,用于后續(xù)的SDS-PAGE分析和酶活力測(cè)定。對(duì)照菌株B.subtilis168/pMA5按照同樣的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.3 酶活力測(cè)定與底物特異性研究

1.2.4 全細(xì)胞生物催化劑的制備

首先,將凍管保存的B.subtilis168/pMA5-lad重組菌株在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線活化,挑取單菌落轉(zhuǎn)接10 mL 50 μg/mL卡那霉素的種子培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)8～12 h后,按10%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接100 mL含相同濃度卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)24 h,以誘導(dǎo)L-AAD表達(dá)。之后,在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,用 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)洗滌菌體2次。最后,將重組枯草芽孢菌體懸浮于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0),測(cè)定OD600,并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞干重(DCW),轉(zhuǎn)化公式為(1)：

DCW/(g·L-1)=0.444 2×OD600-0.021

(1)

1.2.5 全細(xì)胞催化條件優(yōu)化

(1)菌體濃度的優(yōu)化

分別投加不同量的重組枯草芽孢桿菌的菌體于含有100 mmol/LL-亮氨酸的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中,使反應(yīng)體系中菌體終質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20和25 g/L,37 ℃下反應(yīng)24 h,離心取上清液,HPLC檢測(cè)α-酮異己酸濃度。

(2)反應(yīng)溫度的優(yōu)化

用含100 mmol/LL-亮氨酸的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)重懸重組枯草芽孢桿菌的菌體,使菌體質(zhì)量濃度維持在20 g/L,不同溫度(25、30、35、40、45、50、55 ℃)下反應(yīng)24 h,離心取上清液,HPLC檢測(cè)α-酮異己酸濃度。

(3)反應(yīng)pH的優(yōu)化

將20 g/L重組枯草芽孢桿菌菌體和100 mmol/LL-亮氨酸溶解于不同pH(6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0)的50 mL KH2PO4-K2HPO4緩沖液中,于45 ℃下反應(yīng)24 h,離心取上清液,HPLC檢測(cè)α-酮異己酸濃度。

(4)底物L(fēng)-亮氨酸濃度的優(yōu)化

在含有20 g/L重組枯草芽孢桿菌菌體的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 10.0)中,分別投加不同量的L-亮氨酸,使L-亮氨酸終濃度為50、75、100、125和150 mmol/L,45 ℃下反應(yīng)24 h,離心取上清液,HPLC檢測(cè)α-酮異己酸濃度。

1.2.6 金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化體系的影響

在含有20 g/L重組枯草芽孢桿菌菌體、100 mmol/LL-亮氨酸的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 10.0)中添加5 mmol/L Ca2+、Fe2+、Mg2+、Na+、Ba2+、Cu2+、Li+和Al3+),于45 ℃下反應(yīng)24 h,離心取上清液,HPLC檢測(cè)α-酮異己酸濃度,以評(píng)估不同金屬離子對(duì)全細(xì)胞生物催化體系的影響。以不添加任何離子的反應(yīng)混合物作為對(duì)照。

1.2.7 細(xì)胞固定化

將重組枯草芽孢桿菌細(xì)胞與30 g/L海藻酸鈉溶液按1∶1比例進(jìn)行混合,用帶有針頭的注射器將混合液滴入到預(yù)冷的CaCl2溶液(136 mmol/L)中,4 ℃下放置1 h,使所得珠粒硬化,然后過(guò)濾,收集固定化細(xì)胞并用無(wú)菌水洗滌2次,以去除過(guò)量的Ca2+和未結(jié)合的細(xì)胞[19]。

利用游離細(xì)胞及固定化細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑,重復(fù)批次進(jìn)行轉(zhuǎn)化,測(cè)試全細(xì)胞催化劑的可回收性,即可再利用性。反應(yīng)在裝有1 g游離細(xì)胞/固定化細(xì)胞的50 mL/500 mL三角瓶中進(jìn)行(DCW終質(zhì)量濃度20 g/L),45 ℃、200 r/min搖床反應(yīng)24 h,離心,回收上清液,HPLC檢測(cè)α-酮異己酸濃度。然后將反應(yīng)溶液分別繼續(xù)加入到相應(yīng)的細(xì)胞沉淀中,45 ℃、200 r/min搖床反應(yīng)24 h,離心,回收上清液,HPLC檢測(cè)α-酮異己酸濃度。共重復(fù)3個(gè)循環(huán),將第1次轉(zhuǎn)化結(jié)束時(shí),轉(zhuǎn)化液中α-酮異己酸的含量定義為100%。

1.2.8 α-酮異己酸的HPLC檢測(cè)分析

采用伯樂(lè)AminexHPX-87H(300 mm×7.8 mm,9 μm)色譜柱,流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4溶液,流速為0.6 mL/min,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量10 μL,在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm下檢測(cè)α-酮異己酸含量[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilis 168/pMA5-lad重組菌株的構(gòu)建與表達(dá)

以lad-F和lad-R為引物,以pUC57-lad質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增獲得含同源臂的lad基因片段,基因大小為1 416 bp,回收后的lad基因片段與pMA5線性化質(zhì)粒進(jìn)行同源重組連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109。提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證(圖2-a),驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pMA5-lad。重組質(zhì)粒pMA5-lad轉(zhuǎn)化B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證正確的重組菌株命名為B.subtilis168/pMA5-lad(圖2-b)。

P.vulgaris來(lái)源的L-氨基酸脫氨酶是一種膜結(jié)合型蛋白,用1.2.2所述方法進(jìn)行L-AAD的誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果顯示,B.subtilis168/pMA5-lad上清液在51 kDa附近有條帶加粗,即L-AAD成功實(shí)現(xiàn)了在B.subtilis168中的異源表達(dá)(圖2-c)。

a-重組質(zhì)粒單雙酶切驗(yàn)證結(jié)果,泳道M：10 000 bp核酸Marker,泳道1、3、5為重組質(zhì)粒單酶切驗(yàn)證結(jié)果,泳道2、4、6為重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果；b-泳道M：10 000 bp核酸Marker,泳道1、2、3、4為轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果；c-L-AAD在B.subtilis 168中的表達(dá),泳道1為重組菌株B.subtilis 168/pMA5-lad細(xì)胞破碎上清液,泳道2為對(duì)照菌株B.subtilis 168/pMA5細(xì)胞破碎上清液

2.2 L-AAD酶的酶活測(cè)定與底物特異性研究

不同來(lái)源的L-AAD的底物類型不同,一般多數(shù)L-AAD的底物范圍較廣(主要是天然氨基酸),來(lái)自厚葉藻類(Amphiroacrassissima)的L-AAD 可以催化脂肪族、芳香族、基本的、硫化的、γ-羧化的氨基酸[27]。來(lái)自老鼠腎臟的L-AAD 可以催化像S-腺苷-L-高半胱氨酸、高半胱氨酸、腺苷蛋氨酸等天然氨基酸衍生物[28]。來(lái)自不透明紅球菌的L-AAD 底物范圍更廣,不僅可以利用20種常見(jiàn)氨基酸,而且還能利用19種氨基酸衍生物[29]。接下來(lái),對(duì)P.vulgaris來(lái)源的L-AAD進(jìn)行功能驗(yàn)證,同時(shí)測(cè)試其底物特異性,探索研究了L-AAD對(duì)亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、絲氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸這18種氨基酸的底物特異性,結(jié)果顯示,P.vulgaris來(lái)源的L-AAD的底物范圍較廣,其中,對(duì)絲氨酸的特異性最高,其次是丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(圖3),以A520最高的定義為100%。

圖3 L-AAD的底物特異性

2.3 全細(xì)胞催化條件的優(yōu)化

2.3.1 菌體濃度的優(yōu)化

菌體濃度在一定程度上反映了酶的含量,因此,測(cè)試了不同菌體質(zhì)量濃度(5、10、15、20和25 g/L)對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成 α-酮異己酸的影響,結(jié)果如圖4所示,DCW在5～20 g/L范圍內(nèi),隨著DCW質(zhì)量濃度增大,反應(yīng)體系中L-AAD增多,生化反應(yīng)過(guò)程加快,α-酮異己酸含量逐漸增多。DCW質(zhì)量濃度達(dá)20 g/L時(shí),α-酮異己酸含量達(dá)到最高,為1.59 g/L。當(dāng)DCW質(zhì)量濃度高于20 g/L時(shí),可能是菌體質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí),菌體的生長(zhǎng)也需要大量的氧氣,L-AAD氧化脫氨反應(yīng)也是一個(gè)耗氧過(guò)程,不利于脫氨反應(yīng)的進(jìn)行,因此,α-酮異己酸含量逐漸下降,即高細(xì)胞密度不利于生物轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸。由此可見(jiàn),全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成 α-酮異己酸的最適菌體質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖4 菌體濃度對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

2.3.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

溫度通過(guò)影響酶促反應(yīng)速率進(jìn)而影響α-酮異己酸的合成?？刂瞥跏紁H 7.0、底物L(fēng)-賴氨酸濃度為100 mmol/L、菌體量DCW為20 g/L,分別在25、30、35、40、45和55 ℃下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸,結(jié)果如圖5所示。在25～45 ℃范圍內(nèi),α-酮異己酸的含量隨著溫度升高而升高,當(dāng)溫度為45 ℃時(shí),α-酮異己酸的含量最高,為1.92 g/L。而溫度高于45 ℃時(shí),α-酮異己酸的含量則逐漸下降。由此可見(jiàn),全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成 α-酮異己酸的最適反應(yīng)溫度為45 ℃,這可能與L-AAD的最適反應(yīng)溫度有關(guān)。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

2.3.3 反應(yīng)pH的優(yōu)化

維持反應(yīng)溫度45 ℃、底物L(fēng)-賴氨酸濃度為100 mmol/L、菌體量DCW為20 g/L,其他條件相同情況下,在初始pH分別為6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸,結(jié)果如圖6所示。在pH 6.0～10.0范圍內(nèi),α-酮異己酸的含量隨著pH升高而升高,當(dāng)pH為10.0時(shí),α-酮異己酸的含量最高,為2.27 g/L。而pH高于10.0時(shí),α-酮異己酸的含量則逐漸下降。由此可見(jiàn),全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成 α-酮異己酸的最適反應(yīng)pH為10.0,可能與L-AAD的最適反應(yīng)pH有關(guān)。

圖6 反應(yīng)pH對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

2.3.4 底物L(fēng)-亮氨酸濃度的優(yōu)化

底物L(fēng)-亮氨酸濃度是全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸的重要因素。控制反應(yīng)溫度45 ℃、初始pH 10.0、菌體量DCW為20 g/L,在底物L(fēng)-賴氨酸濃度分別為50、75、100、125和150 mmol/L條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,考察底物L(fēng)-亮氨酸濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸的影響,結(jié)果如圖7所示。底物在較低濃度50～100 mmol/L濃度范圍內(nèi),L-AAD的催化效率逐漸提高,α-酮異己酸濃度隨底物濃度升高而升高；底物濃度超過(guò)100 mmol/L時(shí),可能L-AAD酶活性受到抑制,L-AAD酶活性降低,生物轉(zhuǎn)化過(guò)程變慢,α-酮異己酸濃度降低。由此可見(jiàn),全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成 α-酮異己酸的最適底物L(fēng)-亮氨酸濃度為100 mmol/L,此時(shí),α-酮異己酸含量高達(dá)2.27 g/L。

圖7 底物L(fēng)-亮氨酸濃度對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

2.4 金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化體系的影響

測(cè)試了分別添加5 mmol/L CaCl2、FeCl2、MgCl2、NaCl、BaCl2、CuCl2、LiCl和AlCl3對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸的影響,結(jié)果如圖9所示。Ca2+、Fe2+、Ba2+和Cu2+的存在抑制了L-AAD酶的活性,不利于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸,而Mg2+、Na+、Li+和Al3+的存在對(duì)L-AAD酶的活性起激活作用,因此,促進(jìn)了α-酮異己酸的合成(圖8),尤其是Mg2+的存在,使得α-酮異己酸濃度提高了60.79%。

圖8 不同金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

2.5 細(xì)胞固定化

細(xì)胞固定化是提高全細(xì)胞生產(chǎn)率的常用技術(shù),固定化細(xì)胞比游離細(xì)胞更容易分離細(xì)胞和產(chǎn)物。另外,細(xì)胞的固定化允許連續(xù)操作而無(wú)需細(xì)胞沖洗和稀釋反應(yīng)溶液,這可以用來(lái)克服由于高濃度的底物或產(chǎn)物而產(chǎn)生的任何抑制作用[30]。

本文研究了細(xì)胞固定化對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸的影響。從圖9-a可以看出,控制條件完全一致情況下,固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化所獲得的α-酮異己酸含量(2.56 g/L)要率低于游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化所獲得的α-酮異己酸含量(3.66 g/L),這可能是固定化細(xì)胞生物催化劑由于受到海藻酸鈉屏蔽作用,減少了基質(zhì)和細(xì)胞之間的接觸面積,因此,反應(yīng)速率有所下降,α-酮異己酸含量降低。

a-細(xì)胞固定化對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸的影響；b-游離細(xì)胞及固定化細(xì)胞的重復(fù)批次轉(zhuǎn)化

但是,固定化細(xì)胞催化劑在重復(fù)3次轉(zhuǎn)化中顯示出優(yōu)異的性能(圖9-b),再利用率提高了37.3%。這是由于L-AAD與海藻酸鈉的交聯(lián)作用使得L-AAD更加穩(wěn)定,可保護(hù)細(xì)胞免受外部環(huán)境影響。

3 討論

本文首次成功實(shí)現(xiàn)了P.vulgarise來(lái)源的L-AAD在食品安全菌株B.subtilis168中的異源表達(dá),構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-lad,以20 g/L的重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-lad菌體作為全細(xì)胞催化劑,在L-亮氨酸濃度100 mmol/L、反應(yīng)溫度45 ℃、pH 10.0、MgCl2濃度5 mmol/L的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下,連續(xù)轉(zhuǎn)化24 h,可實(shí)現(xiàn)一步法生物合成α-酮異己酸,α-酮異己酸含量達(dá)3.66 g/L,產(chǎn)率為0.15 g/(L·h),在細(xì)胞固定化及重復(fù)批次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,固定化細(xì)胞的再利用率提高了37.3%。

BüCKKE-VALLANT等[13]利用谷氨酸棒桿菌直接發(fā)酵獲得了9.23 g/L的α-酮異己酸,產(chǎn)率達(dá)0.17 g α-酮異己酸/g葡萄糖,存在副產(chǎn)物多及氨基酸缺陷問(wèn)題；之后,為解決氨基酸缺陷問(wèn)題構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌直接發(fā)酵可獲得6.1 g/L的α-酮異己酸,產(chǎn)率卻僅為0.014 g α-酮異己酸/g葡萄糖,而且未完全解決氨基酸缺陷問(wèn)題[14]。雖然,目前,大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-酮異己酸的產(chǎn)量已高達(dá)86.55 g/L,產(chǎn)率達(dá)到3.6 g/(L·h)[25],處于較高水平,但大腸桿菌可能會(huì)將不符合食品衛(wèi)生要求的有害物質(zhì)帶入產(chǎn)品中,限制了α-酮異己酸在食品、醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用。本研究構(gòu)建的可實(shí)現(xiàn)α-酮異己酸安全生產(chǎn)的重組枯草芽孢桿菌,雖然產(chǎn)量不高,僅達(dá)3.66 g/L,且產(chǎn)率僅為0.15 g/(L·h),但為α-酮異己酸的工業(yè)化安全生產(chǎn)提供了一種新策略。在接下來(lái)研究中,將會(huì)對(duì)L-AAD的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析,采取有效策略,對(duì)L-AAD進(jìn)行理性改造,以進(jìn)一步提高L-AAD的酶活水平,提高生物轉(zhuǎn)化效率,進(jìn)而提高α-酮異己酸的產(chǎn)量。