王明明 王磊 竇芳 李韋韋 文愛東 王婧雯

摘 要 目的：研究β-乳香酸對大鼠海馬神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷的改善作用。方法：將大鼠海馬神經(jīng)元細胞分為正常對照組、模型組和β-乳香酸低、中、高濃度組（1、10、100 μmol/L），除正常對照組外，其余各組細胞加入相應含藥培養(yǎng)基，并進行氧糖剝奪培養(yǎng)以復制氧糖剝奪損傷模型。采用MTT法檢測細胞的存活率，采用化學比色法檢測細胞上清液中乳糖脫氫酶（LDH）活性，采用Hoechst-PI染色法觀察細胞形態(tài)的變化，采用流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率，采用Western blot法檢測細胞中凋亡相關蛋白[B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）]的表達。結(jié)果：與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組細胞存活率、Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），細胞上清液中LDH活性、細胞早期凋亡率和細胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白表達水平均顯著降低 （P<0.05或P<0.01）;細胞核致密濃染、碎片狀現(xiàn)象明顯減少。結(jié)論：β-乳香酸可改善大鼠海馬神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷，其作用機制可能與下調(diào)cleaved caspase-3、Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達有關。

關鍵詞 β-乳香酸;海馬神經(jīng)元細胞;氧糖剝奪;細胞凋亡

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of β-boswellic acid on hippocampal neurons cells injury of rats induced by oxygen-glucose deprivation. METHODS： The hippocampal neurons cell of rats were divided into normal control group， model group and β-boswellic acid low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （1， 10， 100 μmol/L）. Except for normal control group， other groups were cultured with relevant medium and given oxygen glucose deprivation to induce oxygen-glucose deprivation induced injury model. MTT assay was adopted to detect cell viability. Chemical colorimetry was used to detect LDH activity in cell culture supernatant. Hoechst-PI staining was used to detect the morphology change of cells. Flow cytometry was used to detect early apoptosis rate of cells. The expression of apoptosis-related protein （Bcl-2， Bax and cleaved caspase-3） were detected by Western blot. RESULTS： Compared with model group， the survival rate of cells and protein expression of Bcl-2 were increased significantly in β-boswellic acid medium-concentration and high-concentration groups （P<0.01）， while LDH activity， early apoptosis rate， protein expression of cleaved caspase-3 and Bax were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The densely stained nuclei and fragmentation decreased significantly. CONCLUSIONS： β-boswellic acid can relieve oxygen-glucose deprivation induced injury of hippocampal neurons cells， the mechanism of which may be associated with down-regulating the protein expression of cleaved caspase-3 and Bax and up-regulating the protein expression of Bcl-2.

KEYWORDS? ?β-boswellic acid; Hippocampal neurons cells; Oxygen-glucose deprivation; Cell apoptosis

腦卒中是引起人類死亡和殘疾的第二大病因，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復發(fā)率及經(jīng)濟負擔重的特點，嚴重影響國民健康;其中，80%的患者為缺血性卒中[1]。缺血性腦卒中是因大腦動脈血流短暫或持久性的閉塞導致腦供血不足或中斷，進而誘發(fā)一系列級聯(lián)反應，造成缺血區(qū)腦組織不可逆的損傷，導致神經(jīng)功能缺陷[2]。海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，是腦組織中對缺血缺氧最敏感的部位之一[3-4]，因此，抑制海馬神經(jīng)元細胞凋亡可有效減輕缺血性腦損傷的程度，進而防治缺血性腦卒中[5]。

乳香為橄欖科植物乳香樹 Boswellia carterii Birdw.及同屬B. bhaur dajiana Birdw.樹皮滲出的樹脂，目前已被歐洲藥品管理局列為治療腦癌水腫的潛在治療藥物[6]，其中β-乳香酸是其重要的藥效物質(zhì)[7]。相關研究發(fā)現(xiàn)，β-乳香酸可促進海馬神經(jīng)元的生長和分支;另外，其在大鼠腦組織中的濃度明顯高于乳香的其他藥效成分，具有較高的血腦屏障滲透率[8-9]。但β-乳香酸是否對缺血性腦卒中具有治療作用，尚不明確。

基于此，本研究以大鼠海馬神經(jīng)元細胞為研究對象，建立氧糖剝奪損傷模型，通過檢測細胞凋亡情況和凋亡相關蛋白[B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）]的表達，探討β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷的改善作用，以期為β-乳香酸防治缺血性腦血管疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：HF-90型CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司），IX53型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），ELX-800型酶標儀（美國Bio-Tek公司），H-2050R型超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），NW10LVF型超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），DYY-7C型電泳儀、WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司），NovoCyte型流式細胞儀（艾森生物有限公司），DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：β-乳香酸（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號P1513，純度不低于95%），胰蛋白酶（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號0103），DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號SH30027），胎牛血清（以色列BI公司，批號04-011-1A），Neurobasal培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、細胞培養(yǎng)添加劑B27（美國Gibco公司，批號分別為12348-017、25030-149、17504-044），阿糖胞苷（日本TCI公司，批號C2035），磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、蛋白上樣緩沖液、碘化丙啶（PI）、細胞裂解液、ECL發(fā)光液（上海碧云天生物技術研究所，批號分別為ST476、ST038、P0015、ST511、P0013、P0018），MTT試劑、乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、兔抗大鼠cleaved caspase-3單克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2 單克隆抗體、兔抗大鼠Bax單克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，批號分別為WLA021、WLA072、WLA004、WLA001、WLA023、WL02117、WL01556、WL01637、WL01372）。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD新生大鼠（出生2天），雄性，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（陜）2019-001。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±1） ℃、濕度為45%～55%，飼養(yǎng)過程中大鼠自由進食飲水。

2 方法

2.1 原代海馬神經(jīng)元細胞的分離與培養(yǎng)

參考文獻[10]并對方法改良后進行細胞分離培養(yǎng)。取新生大鼠，置于 75%乙醇中浸泡5 min，于無菌條件下取出其腦組織，分離海馬組織，以PBS洗凈殘血后剪碎，放入無菌離心管中，加入0.125%胰蛋白酶，于37 ℃條件下水浴5 min進行消化;將消化后的混懸液反復吹打溶液，靜置，待自然沉淀后棄去上清液;沉淀中加入0.125%胰蛋白酶繼續(xù)消化，待自然沉淀后收集上清液;然后向上清液中加入含10%胎牛血清和青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基以中和消化酶，然后以70 μm孔徑的一次性細胞濾網(wǎng)過濾，取上清液，以1 000 r/min離心7 min，棄上清液;將沉淀接種至多聚賴氨酸包被的6孔板中，于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)8 h后，換成含2%B27和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺及100 U/mL青/鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細胞生長，每隔3 天換液1次，培養(yǎng)7～10天后進行后續(xù)試驗。

2.2 海馬神經(jīng)元細胞分組、造模與給藥

取海馬神經(jīng)元細胞分為正常對照組、模型組和β-乳香酸不同濃度組（1、10、100 μmol/L，濃度根據(jù)文獻[11-12]設置）。正常對照組和模型組加入含2%B27和0.5 mmol/L谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基1 mL;β-乳香酸各濃度組加入含相應藥物以及含2%B27和0.5 mmol/L? ?L-谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基1 mL。各組細胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，將β-乳香酸各濃度組和模型組的培養(yǎng)基更換為無糖DMEM培養(yǎng)基，并將細胞置于缺氧造模盒內(nèi)，通入混合氣體（含有95%N2、5%CO2），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h以誘導建立氧糖剝奪模型[13-14];正常對照組繼續(xù)用含2%B27和0.5 mmol/L谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，不作缺氧缺糖處理。造模結(jié)束將各組培養(yǎng)基更換為含2%B27和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基（β-乳香酸各濃度組繼續(xù)加入相應藥物）。

2.3 海馬神經(jīng)元細胞存活率的測定

采用MTT法進行檢測。取“2.1”項下海馬神經(jīng)元細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中，然后按“2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。細胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，加入MTT染色液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去上清液，加入DMSO 150 μL以溶解細胞，避光靜置10 min后，采用酶標儀于570 nm波長下測定各孔吸光度值（OD），并計算細胞存活率[細胞存活率（%）=（OD實驗組/OD正常對照組）×100%]。實驗重復3次。

2.4 海馬神經(jīng)元細胞上清液中LDH活性的測定

采用化學比色法進行檢測。取“2.1”項下海馬神經(jīng)元細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中，然后按“2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。細胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液上清液，根據(jù)LDH測定試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀于440 nm波長處測定各孔OD，并計算LDH 活性。

2.5 海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)的觀察

采用Hoechst-PI染色法進行觀察。取“2.1”項下海馬神經(jīng)元細胞，以5×103個/孔接種于置有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，按“2.2”項下方法分組、造模與給藥。細胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，滴加Hoechst熒光染料（10 μg/mL），于37 ℃條件下孵育10 min;以PBS清洗3次，加入1 μg/mL PI，于4 ℃條件下孵育20 min;滴加預冷的4%多聚甲醛固定15 min;以 PBS清洗3次，然后采用熒光倒置顯微鏡觀察（正常細胞的細胞核經(jīng)Hoechst染色后呈淡藍色圓形狀，凋亡細胞的細胞核經(jīng)Hoechst染色后呈亮藍色分葉、碎片狀;死細胞或晚期凋亡細胞因細胞膜被破壞，可被PI染成亮紅色[15]）。

2.6 海馬神經(jīng)元細胞早期凋亡率的檢測

取“2.1”項下海馬神經(jīng)元細胞，以5×103個/孔接種于具有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，按“2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。細胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，以1 000 r/min離心5 min，收集細胞，以PBS清洗2次，棄上清液;加入Binding buffer 500 μL輕輕重懸細胞;加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，再加入PI 10 μL，室溫避光孵育15 min，然后采用流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡率。

2.7 海馬神經(jīng)元細胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.1”項下海馬神經(jīng)元細胞，以5×103個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，按“2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。細胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液，以PBS沖洗3次，加入適量裂解液，于冰上裂解30 min;以10 000 r/min離心5 min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜;以TBST清洗5 min，以5%脫脂奶粉溶液封閉1 h;加入cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin一抗、（稀釋度分別為1 ∶ 400、? ? 1 ∶ 500、1 ∶ 500、1 ∶ 500），于4 ℃條件下孵育過夜;以TBST清洗5 min×4次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫振蕩孵育1 h;以TBST 清洗5 min×6次，加入 ECL發(fā)光液，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描。采用Image J v1.44軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值的比值來表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細胞存活率的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細胞存活率顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細胞存活率均顯著升高（P<0.01），詳見圖1。

3.2 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細胞上清液中LDH活性的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細胞上清液中LDH活性顯著升高（ P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細胞上清液中LDH活性均顯著降低（ P<0.01），詳見圖2。

3.3 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)的影響

正常對照組海馬神經(jīng)元細胞染色均勻，細胞核形態(tài)完整;模型組海馬神經(jīng)元細胞的細胞核呈致密濃染，可見核固縮和核碎片現(xiàn)象;β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細胞染色均勻，細胞核致密濃染、核碎片狀現(xiàn)象明顯減少;β-乳香酸低劑量組海馬神經(jīng)元細胞的細胞核仍存在致密濃染，核固縮和碎片仍顯著，詳見圖3。

3.4 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細胞早期凋亡率的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細胞早期凋亡率顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細胞早期凋亡率均顯著降低（P<0.05 或 P<0.01），詳見圖4、圖5。

3.5 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達水平均顯著升高（ P<0.01），Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低（ P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或 P<0.01），Bcl-2蛋白的表達水平均顯著升高 （ P<0.05或 P<0.01），詳見圖6、圖7。

4 討論

缺血性腦卒中是危害人類健康的主要疾病之一。發(fā)生缺血性腦卒中后，由于缺氧缺糖導致腦細胞，尤其是神經(jīng)元細胞損傷，是造成神經(jīng)功能缺陷的主要原因，因此減少神經(jīng)元細胞損傷是減輕缺血性腦卒中病情的策略之一[16]。海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動有關，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺氧耐受相對較差的部位[15]。因此，本研究選擇海馬神經(jīng)元細胞來建立氧糖剝奪損傷模型。

乳香由樹脂、樹膠和揮發(fā)油等組成，其中含量較高的是樹脂（約60%～70%），其主要成分有游離的α-乳香酸、β-乳香酸、11-酮基-β-乳香酸等[17]。相關研究發(fā)現(xiàn)，β-乳香酸在神經(jīng)可塑性中發(fā)揮著核心作用，具有促進海馬神經(jīng)元生長和分支的作用[18]。本研究結(jié)果顯示，10、100 μmol/L的β-乳香酸可顯著升高氧糖剝奪損傷模型海馬神經(jīng)元細胞的存活率，表明β-乳香酸可通過提高海馬神經(jīng)元細胞的存活率，減輕其氧糖剝奪損傷。

LDH廣泛存在于人體各組織內(nèi)，正常細胞中LDH漏出量很少，而當其受損時，細胞膜的完整性和通透性被破壞，使得LDH漏出[19]。因此，檢測海馬神經(jīng)元細胞上清液中 LDH的活性，即可間接反映細胞的受損程度。本研究結(jié)果顯示，10、100 μmol/L的β-乳香酸可降低氧糖剝奪損傷海馬神經(jīng)元細胞上清液中 LDH的活性;進一步研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元細胞的細胞核致密濃染、碎片狀現(xiàn)象較模型組明顯減少，細胞早期凋亡率也顯著降低，說明β-乳香酸可通過減少細胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的氧糖剝奪損傷。

相關研究發(fā)現(xiàn)，caspase家族、Bcl-2家族等相關蛋白可參與細胞凋亡的過程;其中，caspase家族相關蛋白可參與細胞凋亡的各個時期[20-21]。該家族由14個成員組成，在正常細胞中均以無活性的酶原形式存在;其中caspase-3在細胞凋亡的級聯(lián)反應途徑中位于核心位置，是凋亡信號轉(zhuǎn)導下游的執(zhí)行者，主要分布于細胞質(zhì)中，初始無活性，當收到凋亡信號刺激被激活后，活化為cleaved caspase-3[20]。Bcl-2分布于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，位于線粒體上游，可通過調(diào)節(jié)線粒體膜間隙蛋白的釋放來調(diào)控細胞凋亡;Bax定位于細胞質(zhì)，是Bcl-2家族重要的促凋亡因子[21]。本研究結(jié)果顯示，10、100 μmol/L的β-乳香酸可顯著降低氧糖剝奪損傷模型海馬神經(jīng)元細胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平，升高Bcl-2蛋白表達水平，表明β-乳香酸可通過下調(diào)cleaved caspase-3、Bax蛋白表達以及上調(diào)Bcl-2蛋白表達來抑制細胞凋亡，從而改善海馬神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷。

綜上所述，β-乳香酸可改善大鼠海馬神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷，其作用機制可能與下調(diào)cleaved caspase-3、Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達有關。

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（收稿日期：2021-01-11 修回日期：2021-03-28）

（編輯：唐曉蓮）