肖 瑤，蔣經(jīng)偉，李石磊，董 穎，周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連 116023 )

酚氧化酶(PO)作為無脊椎動物先天性免疫系統(tǒng)中關鍵的免疫組分之一，其自身通常不具有殺菌或抑菌活性，但可以催化酚類底物生成醌類，醌類再經(jīng)過一系列的非酶促反應最終生成黑色素[1]。醌類物質被報道具有殺菌和抑菌等作用，而黑色素也被發(fā)現(xiàn)具有凝集病原菌、修復損傷和介導吞噬等作用[2]。

酚氧化酶免疫功能的發(fā)揮與其自身的生化和酶學特性密切相關[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，用純化后的酚氧化酶進行的生化及酶學特性研究，對了解酚氧化酶的免疫特性具有重要意義，酚氧化酶的分離純化及生化特性研究在昆蟲和甲殼類動物中已有廣泛報道[4]，在無脊椎動物體內，除血淋巴外，其他組織在常態(tài)下酚氧化酶不表達，而在應激狀態(tài)下可迅速啟動潛在的酚氧化酶表達和釋放能力，從而增強機體的免疫和抵抗水平[5]。因此，了解酚氧化酶的生化和酶學特性對解析酚氧化酶的免疫功能具有重要意義。目前在悉尼巖牡蠣(Saccostreaglomerata)[2]、光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)[6]、阿根廷滑柔魚(Illexargentinus)[7]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[8]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[9]等海洋無脊椎動物中，相繼開展了酚氧化酶的生化與酶學特性分析。在光棘球海膽和櫛孔扇貝中，各發(fā)現(xiàn)了3種酚氧化酶，在悉尼巖牡蠣中發(fā)現(xiàn)了2種酚氧化酶[2,6-9]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是棘皮動物門的典型代表生物，具有較高的經(jīng)濟價值，是我國海水增養(yǎng)殖的重要品種之一[5,10]。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，病害時有發(fā)生[11]。研究仿刺參的免疫和生理特性，對其病害防控具有重要意義。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參幼參體腔液中含有3種酚氧化酶[12]，分別為AjPO1、AjPO2和AjPO3。這3種酚氧化酶的分子質量均小于21 ku，具有不同的生理、生化特性，并且承擔不同的免疫功能。之后在仿刺參成參的體腔上清液和體腔細胞中發(fā)現(xiàn)了與幼參相同的AjPO2和AjPO3，同時在成參體腔細胞中又發(fā)現(xiàn)了3種新酚氧化酶，這3種酚氧化酶在仿刺參雌、雄個體間的分布存在差異，其中雌性個體的體腔細胞中3種酚氧化酶同時存在，而雄性個體的體腔細胞中僅有2種酚氧化酶存在[13]。目前仿刺參成參體腔細胞中酚氧化酶系統(tǒng)的具體生化特性和功能的相關研究尚未見報道。

筆者自仿刺參成參體腔細胞中分離純化出4種酚氧化酶，對4種酚氧化酶的耐熱性、最適pH、底物特異性、反應動力學參數(shù)、二價金屬離子和抑制劑對酶活性的影響方面進行研究，為進一步查明仿刺參成參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能機制、探索酚氧化酶系統(tǒng)在仿刺參中的免疫和生理功能提供基礎支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

體質量(236±5) g仿刺參雌、雄各30頭，在仿刺參產(chǎn)卵時，根據(jù)排精排卵來判斷雌雄，并將雌、雄仿刺參分別于試驗室暫養(yǎng)(水溫15～18 ℃，pH 8.1～8.3，鹽度31)7 d。樣品均取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院海水養(yǎng)殖引育種中心。

1.2 體腔細胞破碎液的制備

用剪刀分別將雌、雄仿刺參從腹部劃開，收集仿刺參體腔液，分別進行離心(4 ℃，6000 r/min，10 min)，棄上清液，將雌、雄仿刺參的體腔細胞分別充分混勻后，加入磷酸緩沖液，經(jīng)超聲波破碎后再次進行離心(4 ℃，14 000 r/min，25 min)，取體腔細胞破碎上清液，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 仿刺參酚氧化酶的分離純化

采用鄰苯二酚發(fā)色法結合線性連續(xù)梯度非變性電泳的方法來分離雌、雄仿刺參體腔細胞破碎液中的酚氧化酶[11]。在含量為6%～18%的線性連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳17 h(4 ℃，恒功率2 W)，使用分子質量為480～1236 ku的非變性電泳Marker作為標準蛋白參考；電泳結束后，參考文獻[6]分離光棘球海膽酚氧化酶的操作方法進行雌、雄仿刺參酚氧化酶的分離純化。將純化后的雌、雄仿刺參的酚氧化酶溶液，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用多巴絡合物生成法[14]測定酚氧化酶活性，在490 nm波長下連續(xù)測定吸光度值(D490)，D490每分鐘增加0.001定義為1個酶活性單位(U)。將時間和測得吸光度值的線性規(guī)律繪制標準曲線得到公式(1)，將不同條件下的吸光度值分別代入公式(1)即可得到不同條件下的酶活性。

y=kx+b

(1)

式中，x為時間，y為吸光度值，斜率k的絕對值即酶活性，b為截距。

1.4 pH和高溫對酶活性的影響

用濃度15 mmol/L的左旋多巴溶于pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中，通過向1.5 mol/L的Tris溶液中滴加濃鹽酸的方法來調節(jié)緩沖液的pH，100 μL純化后的酚氧化酶溶液與2.0 mL不同pH的左旋多巴溶液混勻后，采用分光光度法在490 nm波長下測定吸光度值，分別代入標準曲線計算各組酚氧化酶活性。

將4種酚氧化酶分別在沸水中加熱5、10、20、30 min，以20 mmol/L多巴胺為底物與加熱后4種酚氧化酶混合，采用分光光度法在490 nm波長下測定吸光度值，分別代入標準曲線計算各組酚氧化酶活性。

開孔鋼板連接件(perfobond strip connector，也稱為PBL連接件)是1987年，德國學者Leonhardt在解決委內瑞拉的卡羅尼第三大橋組合結構剪力連接件的疲勞問題時提出的一種新型剪力連接件[2].PBL連接件是通過開孔鋼板在混凝土板中形成的一系列混凝土榫、開孔鋼板和貫穿鋼筋共同承擔剪力.

1.5 二價金屬離子對酶活性的影響

選用Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+、Cd2+、Fe2+、Zn2+進行二價金屬離子對酚氧化酶活性影響的試驗，分別使用CaCl2、MgSO4、CuSO4、MnSO4、Pb(CH3COO)2、CdCl2、FeSO4、ZnSO4作為金屬離子的來源，采用超純水作為空白對照，參照文獻[6]的方法操作。得到的混合物用分光光度法在490 nm波長下測定吸光度值，分別代入標準曲線計算各組酚氧化酶活性。

1.6 抑制劑對酶活性的影響

選取抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、二乙基二硫代氨基甲酸鈉作為酚氧化酶的抑制劑，超純水作為空白對照，并參照文獻[6]的試驗方法操作。得到的混合物采用分光光度法，在490 nm波長下測定吸光度值, 分別代入標準曲線計算各組酚氧化酶活性。

1.7 底物特異性

選用鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對苯二酚作為不同底物，對照組用等體積的Tris-HCl緩沖液(pH 7)，參照文獻[6]的試驗方法操作，得到的混合物用分光光度法在490 nm波長下測定吸光度值，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算各組酚氧化酶活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析及Duncan多重比較，獲得不同抑制劑對酶活性作用的差異性，P<0.05視為顯著抑制，P<0.01視為極顯著抑制，用Origin 7.5軟件制圖。

2 結 果

2.1 仿刺參酚氧化酶的分離純化

非變性電泳后，經(jīng)鄰苯二酚發(fā)色，共發(fā)現(xiàn)4條酚氧化酶條帶，均呈現(xiàn)褐色(圖1a)。為區(qū)別于仿刺參幼參體內的3種酚氧化酶，將這4種酚氧化酶按分子質量由高到低分別命名為AjPO4、AjPO5、AjPO6、AjPO7，與右側(圖1b)Jiang等[13]的試驗結果進行對比，可知AjPO5為本次試驗發(fā)現(xiàn)的新酚氧化酶，這4種酚氧化酶的分子質量均大于Marker中標準蛋白分子質量為720 ku的條帶，其中分子質量越小的條帶遷移速率越快。

圖1 雌雄仿刺參體腔細胞破碎液非變性電泳圖Fig.1 Native-PAGE of coelomocyte lysate supernatant (CLS) in male and female sea cucumber A. japonicusa:1.非變性電泳標準蛋白； 2～4.雄性仿刺參電泳條帶； 5～7.雌性仿刺參電泳條帶； b:1.雄性仿刺參電泳條帶； 2.雌性仿刺參電泳條帶[12].a:1.protein marker for native-PAGE; 2—4.CLS stained with catechol in male sea cucumber A.japonicus; 5—7.CLS stained with catechol in female sea cucumber A. japonicus； b:1.CLS stained with catechol in sea cucumber male A. japonicus; 2.CLS stained with catechol in female sea cucumber A. japonicus[12].

2.2 pH和溫度對酚氧化酶活性的影響

測定的pH為2.0～10.0，使用多巴胺作為底物，仿刺參中AjPO4和AjPO6在pH為9.0時具有最高活性，AjPO5和AjPO7在pH為8.0時具有最高活性；當pH高于9.0時，4種酚氧化酶的活性隨pH的升高而降低(圖2)。

仿刺參酚氧化酶的耐熱性試驗顯示，AjPO4、AjPO5、AjPO6在沸水中的時長對酶活性基本無太大的影響，耐熱性較好；AjPO7在沸水中的時長超過20 min時酶活性急劇下降，耐熱能力較其他3種弱一些(圖3)。

2.3 二價金屬離子對酚氧化酶活性的影響

Mn2+和Fe2+對仿刺參4種酚氧化酶活性均有很強的激活作用，激活程度隨金屬離子濃度的增加而變化。當Mn2+濃度超過25 mmol/L時，AjPO4酶活性開始降低，Ca2+濃度達到20 mmol/L時，AjPO4酶活性開始降低并逐漸失活。在Mn2+和Fe2+的作用下，AjPO5酶活性隨著金屬離子濃度的增加而增加，Pb2+、Cu2+、Zn2+對AjPO5酶活性有小幅度的激活。除了Mn2+和Fe2+外，其他金屬離子對AjPO6刺激作用并不明顯。在Fe2+的作用下，AjPO7酶活性增強明顯，當Fe2+濃度超過25 mmol/L時，AjPO7的酶活性開始下降，當Cd2+濃度超過15 mmol/L時，該酚氧化酶活性有小幅度增強(圖4)。

圖2 pH對仿刺參酚氧化酶活性的影響Fig.2 The effects of pH on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

圖3 仿刺參酚氧化酶的耐熱性Fig.3 The effects of temperature on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

2.4 抑制劑對酚氧化酶活性的影響

在仿刺參中，亞硫酸鈉、抗壞血酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、檸檬酸對酚氧化酶均有一定的抑制作用，乙二胺四乙酸二鈉對AjPO6和AjPO7有輕微抑制作用，對AjPO4、AjPO5無抑制作用。其中AjPO4、AjPO6和AjPO7受檸檬酸抑制最顯著，AjPO7受二乙基二硫代氨基甲酸鈉抑制較明顯(圖5)。亞硫酸鈉對4種酚氧化酶活性均有一定的抑制作用。

2.5 酚氧化酶的底物特異性和動力學參數(shù)

使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算得出(圖6)，AjPO4對鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為0.25、5.76、50.00、33.33 mmol/L；AjPO5對鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為4.89、6.61、14.29、8.77 mmol/L；AjPO6對鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為1.51、2.65、8.85、14.29 mmol/L；AjPO7對鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為1.63、3.95、13.51、83.33 mmol/L。4種酚氧化酶的最適底物均為鄰苯二酚。

圖4 不同金屬離子對AjPO4、AjPO5、AjPO6和AjPO7的影響Fig.4 The effects of different metal ions on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

圖5 不同抑制劑對仿刺參酚氧化酶活性的影響Fig.5 The effects of different inhibitors on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus*表示顯著抑制(P<0.05)，**表示極顯著抑制(P<0.01).* represents significant inhibition(P<0.05); ** represents very significant inhibition(P<0.01).

3 討 論

3.1 仿刺參體酚氧化酶的分離純化

已有的研究發(fā)現(xiàn)，在仿刺參成參體腔細胞內存在3種不同于仿刺參幼參的酚氧化酶，其中雌性3種，雄性2種[12-13]。筆者在已有基礎上又發(fā)現(xiàn)了1種新的酚氧化酶，這種酚氧化酶為雌、雄仿刺參共有，分子質量為1048～1236 ku，與仿刺參幼參體內酚氧化酶不同。發(fā)現(xiàn)的這4種成參特有的酚氧化酶的分子質量均在720～1236 ku，分別承擔不同的生化特性和免疫反應特性。為確保試驗結果準確性，經(jīng)過多次的反復驗證，80%情況下均可得到此酚氧化酶，由于這4種酚氧化酶在常溫下極易失活，所以存在沒有成功分離純化的情況，且這4種酚氧化酶的含量較低，通過非變性電泳的方法分離可能會出現(xiàn)失敗情況。

3.2 酚氧化酶的底物特異性

這4種酚氧化酶的分子質量在其他物種中已發(fā)現(xiàn)的酚氧化酶中屬于分子質量較大的。自亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)血淋巴中分離純化出酚氧化酶，該酶在非變性電泳中顯示其分子質量為158 ku[14]；在大螯蝦(Panulirusargus)[15]中，采用非變性電泳的方法從血淋巴中分離得到了酚氧化酶，該酶在非變性電泳中顯示分子質量為300 ku；在海洋無脊椎動物中線性連續(xù)梯度非變性電泳中酚氧化酶的分子質量一般大于100 ku[16-17]。但在光棘球海膽的酚氧化酶系統(tǒng)中，酚氧化酶的分子質量是遠小于標準蛋白marker的最小值[6]，這說明兩種生物即使在進化上相似，但也存在著酚氧化酶分子質量差異較大的現(xiàn)象。動力學分析表明，4種酚氧化酶最適底物為鄰苯二酚，米氏常數(shù)Km值分別為0.25、4.89、1.51、1.63。以左旋多巴為底物，仿刺參4種酚氧化酶的最適pH分別為9.0、8.0、9.0、8.0，這意味著，仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)在弱堿性環(huán)境下活性更強。此外，這4種酚氧化酶在pH為5.0～7.0時活力較低，表明pH偏低的酸性條件對仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)的功能可能產(chǎn)生抑制。

3.3 酚氧化酶的耐熱性

通過分析仿刺參酚氧化酶耐熱性的試驗結果，發(fā)現(xiàn)AjPO4、AjPO5、AjPO6 3種酚氧化酶在沸水中的時長對酶活性無明顯影響，可以看出仿刺參酚氧化酶具有很好的耐熱性，這與大多數(shù)海洋無脊椎動物酚氧化酶特征相同；而AjPO7在沸水中超過20 min活性開始急劇下降，AjPO7是雌性仿刺參特有的一種酚氧化酶，其他3種酚氧化酶是雌、雄仿刺參共有。關于AjPO7與其他3種酚氧化酶的耐熱性差異能否對雌、雄仿刺參的耐熱性產(chǎn)生影響，還需進一步研究。

3.4 二價金屬離子對酚氧化酶活性的影響

近年，有關在某些水產(chǎn)養(yǎng)殖動物人工配合飼料中添加金屬離子的報道較多。李荷芳等[18]研究表明，在中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)飼料中添加Mn2+，雖對增長、增質量無明顯影響，但卻能激活肝胰臟中的羧肽酶A；在皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[19-20]人工飼料中添加Ca2+、Fe3+、Mg2+等也有促生長作用。本試驗中以多巴胺為底物，與Fe2+和Mn2+孵育后的4種酚氧化酶活性均有顯著增強，表明這2種金屬離子有助于仿刺參酚氧化酶的催化和酚氧化酶反應速率的提高，由此推測，在仿刺參飼料中添加一定量的Fe2+和Mn2+可能有助于增強仿刺參自身免疫活力。當Fe2+濃度高于25 mmol/L時，其他3種酚氧化酶活性上升，而AjPO7的活性出現(xiàn)明顯的下降，相比與其他3種酚氧化酶，AjPO7受二價鐵離子的影響機制可能存在特殊性。除Fe2+和Mn2+外的二價金屬離子對仿刺參4種酚氧化酶活性的影響均不顯著，這與光棘球海膽酚氧化酶活性受二價金屬離子催化的結果相近[6]，這意味著仿刺參酚氧化酶與光棘球海膽酚氧化酶受二價金屬離子影響的機制可能相似。

3.5 抑制劑對酚氧化酶活性的影響

二乙基二硫代氨基甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和亞硫酸鈉均有較明顯的抑制雌、雄仿刺參4種酚氧化酶活性的作用。其中，二乙基二硫代氨基甲酸鈉是特異性的銅離子螯合劑，表明本試驗中的雌、雄仿刺參4種酚氧化酶含銅[5]，這與其他無脊椎動物酚氧化酶特性相似。然而，檸檬酸對仿刺參酚氧化酶活性的影響與其他海洋脊椎動物如海灣扇貝(Argopectehsirradians)[16]、菲律賓蛤仔[8]、蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)[21]顯著不同，檸檬酸對雌、雄仿刺參4種酚氧化酶的抑制作用很明顯，要強于大多數(shù)海洋無脊椎動物，這意味著酚氧化酶的催化機制在不同物種間并不相同，具體原因和規(guī)律還有待進一步研究。

3.6 AjPO7的特異性

AjPO7作為雌性仿刺參特有的1種酚氧化酶，與其他3種酚氧化酶相比，在耐熱性以及受二價金屬離子影響方面均有其特殊性，AjPO7的這種生化特性可為仿刺參雌雄鑒別技術研究提供基礎數(shù)據(jù)支持。仿刺參這4種酚氧化酶生化與酶學特性的研究，有助于進一步了解仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能，并為刺參免疫增強劑的開發(fā)提供科學指導。

4 結 論

本試驗在仿刺參成參體腔細胞中分離純化出4種酚氧化酶，其中雄性3種，雌性4種，分子質量為720～1236 ku，且具有很好的耐熱性，與大多數(shù)海洋無脊椎動物酚氧化酶的特征相同。4種酚氧化酶均屬于漆酶型酚氧化酶，并對鄰苯二酚的親和力最高。4種酚氧化酶最適pH的研究表明，仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)在弱堿性環(huán)境下活性更強。與Fe2+和Mn2+孵育后的4種酚氧化酶活性均有顯著增強。二乙基二硫代氨基甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和亞硫酸鈉均有較明顯的抑制雌雄仿刺參4種酚氧化酶活性的作用，表明本試驗中的雌、雄仿刺參4種酚氧化酶含銅，與其他無脊椎動物酚氧化酶特性相似。