魏雪靜，張彥寧，徐 瑞，岳 冰，鄭曉丹，柳瑋華，陳光勇

黑色素瘤可發(fā)生于身體各部位，最常見(jiàn)于皮膚，其次為眼、頭頸部、消化道及泌尿生殖道等[1-2]。原發(fā)性消化道黑色素瘤(primary gastrointestinal melanoma, PGIM)較罕見(jiàn)，多數(shù)為轉(zhuǎn)移性，缺乏典型臨床表現(xiàn)，類似于其他消化道腫瘤，易誤診。張彤等[3]總結(jié)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的239例消化道腫瘤中，多數(shù)黑色素瘤術(shù)前誤診為低分化癌、痔或惡性息肉等(176例，73.64%)。PGIM中原發(fā)性肛管直腸黑色素瘤(primary anorectalmalignant melanoma, PAMM)最多見(jiàn)，其次為原發(fā)性食管黑色素瘤(primary malignant melanoma of esophagus, PMME)。本文回顧性分析14例PGIM的臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)、免疫表型，旨在加深對(duì)其的認(rèn)識(shí)水平，為臨床早診斷、早治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院病理科2008年3月～2019年7月存檔的黑色素瘤128例，復(fù)習(xí)病理切片和臨床資料，最終篩選出14例PGIM納入實(shí)驗(yàn)。查閱病例資料，收集包括患者性別、年齡、發(fā)病部位、病變大小、內(nèi)鏡表現(xiàn)、病理特點(diǎn)、治療及隨訪等信息。所有標(biāo)本切片均由兩名高年資病理醫(yī)師進(jìn)行回顧性分析。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，行HE及免疫組化EnVision法染色，所用單克隆抗體包括vimentin、HMB-45、S-100、Mart-1、MUM1、CD117、CK、EMA、CEA、NSE、CD45、DOG1、CD56、Syn、CgA、Ki-67，均購(gòu)自福州邁新公司。陽(yáng)性對(duì)照采用已知陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.2.2qRT-PCR 按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA(廈門艾德生物公司)，將混合好的DNA樣品放入實(shí)時(shí)PCR儀器。PCR的過(guò)程設(shè)置為3個(gè)階段：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)；在第3個(gè)階段60 ℃時(shí)開(kāi)始收集突變FAM信號(hào)和內(nèi)控HEX信號(hào)。根據(jù)不同的突變CT值判斷樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性或者陽(yáng)性。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)FAM熒光信號(hào)產(chǎn)生，陽(yáng)性質(zhì)控品的CT值一般<20，標(biāo)本內(nèi)控12

2 結(jié)果

2.1 臨床特征14例PGIM中，女性8例，男性6例；年齡44～84歲，中位年齡59歲；7例發(fā)生于食管(3例食管中下段，2例食管中段，2例食管下段)，4例發(fā)生于直腸肛管，1例發(fā)生于賁門，1例發(fā)生于胃食管交界處，1例發(fā)生于小腸(表1)；發(fā)生于食管患者以進(jìn)食哽咽感就診，發(fā)生于直腸肛管患者主因腹痛便血、排便困難就診；胃腸患者表現(xiàn)以腹部不適為主。14例患者均行電子胃腸鏡檢查：胃鏡示5例距門齒24～35 cm食管后壁、側(cè)壁見(jiàn)不規(guī)則隆起及結(jié)節(jié)狀腫物，色素沉著不明顯，2例距門齒33～38 cm食管前壁及左后壁見(jiàn)潰瘍型腫物，2例中賁門及胃食管交界處見(jiàn)隆起型腫物；腸鏡示4例距肛門1.5～4 cm、小腸內(nèi)見(jiàn)菜花樣、蕈傘樣及息肉樣腫物，伴表面糜爛，質(zhì)脆、觸之易出血。腫瘤最大徑1～8 cm，切面灰褐色或灰白、灰紅色。除4例術(shù)前活檢得到確診外，其余10例均被誤診為低分化癌、息肉或痔瘡。10例均行全身增強(qiáng)CT檢查，4例行PET-CT檢查，全身皮膚及其它組織器官均未發(fā)現(xiàn)病灶，14例均無(wú)其他腫瘤病史。

2.2 病理特征病變主要位于黏膜下層(僅1例局限黏膜固有層)，腫瘤細(xì)胞排列成彌漫實(shí)性片狀、假乳頭狀(圖1)、腺泡樣、條索狀、束狀、血管瘤樣等結(jié)構(gòu)，部分血管壁增厚，血管周圍可見(jiàn)基膜樣物質(zhì)，病灶鄰近的鱗狀上皮內(nèi)可見(jiàn)黑色素細(xì)胞(圖2)，直腸肛管病變中部分瘤細(xì)胞分布于直腸腺體周圍，局灶腫瘤細(xì)胞與肛管黏膜鱗狀上皮基底層相互移行(圖3、4)。在57%(8/14)的黑色素瘤中可見(jiàn)鱗狀上皮內(nèi)黑色素細(xì)胞的Pagetoid累及；64%(9/14)的病灶區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)局灶性黑色素顆粒沉著。腫瘤細(xì)胞可呈四種表現(xiàn)類型，其中上皮樣細(xì)胞為主型最多見(jiàn)，瘤細(xì)胞圓形、卵圓形或多角形，胞質(zhì)嗜酸，胞核大，大紅核仁，居中(圖5)；梭形細(xì)胞為主型，瘤細(xì)胞核呈梭形，部分呈桿狀，排列成束狀、編織狀，核仁不明顯(圖6)；橫紋肌樣細(xì)胞為主型，細(xì)胞質(zhì)略豐富，粉染，細(xì)胞核偏位，似漿細(xì)胞(圖7)；小細(xì)胞為主型，瘤細(xì)胞體積小，核圓形或卵圓形，染色質(zhì)細(xì)，分布均勻(圖8)。

2.3 免疫表型和qRT-PCR結(jié)果14例中9例HMB-45彌漫陽(yáng)性(圖9)，5例部分陽(yáng)性；9例S-100彌漫陽(yáng)性(圖10)，4例部分陽(yáng)性，1例陰性；14例Mart-1、vimentin、MUM1均陽(yáng)性，3例CD117陽(yáng)性，2例CD56陽(yáng)性(表1)；CK、EMA、CEA、NSE、CD45、DOG1、Syn、CgA均陰性，Ki-67增殖指數(shù)20%～30%。14例BRAF V600E基因突變均為野生型(圖11)。

圖1 食管原發(fā)性黑色素瘤細(xì)胞彌漫分布，局灶上皮樣細(xì)胞圍繞血管呈菊形團(tuán)樣排列 圖2 腫瘤細(xì)胞與黏膜鱗狀上皮基底層相互移行，腫瘤鄰近的上皮組織內(nèi)可見(jiàn)黑色素瘤細(xì)胞 圖3 直腸原發(fā)性黑色素瘤，直腸黏膜腺體周圍彌漫片狀腫瘤細(xì)胞分布，腺體內(nèi)未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)散在黑色素顆粒 圖4 腫瘤細(xì)胞與肛管黏膜鱗狀上皮基底層相互移行，伴有多量黑色素顆粒 圖5 上皮樣細(xì)胞為主型，瘤細(xì)胞圓形、卵圓形或多角形，胞質(zhì)豐富嗜酸，胞核大，可見(jiàn)居中大紅核仁 圖6 梭形細(xì)胞為主型，瘤細(xì)胞核呈梭形，部分呈桿狀，核仁不明顯，排列成束狀、編織狀 圖7 橫紋肌樣細(xì)胞為主型，大部分細(xì)胞核偏位，似漿細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)略豐富，粉染 圖8 小細(xì)胞為主型，瘤細(xì)胞體積小，核圓形或卵圓形，染色質(zhì)細(xì)，分布均勻，呈彌漫性分布 圖9 腫瘤細(xì)胞HMB-45陽(yáng)性，EnVision法 圖10 腫瘤細(xì)胞S-100蛋白彌漫陽(yáng)性，EnVision法

圖11 qRT-PCR檢測(cè)BRAF V600E均為野生型

表1 14例原發(fā)性消化道黑色素瘤臨床病理特征

2.4 隨訪本組14例中1例失訪，13例患者獲得隨訪，隨訪時(shí)間3～48個(gè)月，患者術(shù)后平均生存時(shí)間11個(gè)月，11例患者死亡，均死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中4例為復(fù)發(fā)病例，肝轉(zhuǎn)移2例，肝、肺和骨多發(fā)轉(zhuǎn)移5例；2例患者分別隨訪23及25個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移征象。

3 討論

黑色素瘤具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散快、臨床預(yù)后差等特點(diǎn)，是由神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞惡變產(chǎn)生的一種少見(jiàn)腫瘤。我國(guó)黑色素瘤的發(fā)病率較低，且有關(guān)PGIM臨床病理學(xué)方面的報(bào)道多數(shù)為個(gè)案或小宗病例報(bào)道，臨床內(nèi)鏡診斷多數(shù)為誤診病例[4-6]。

3.1 臨床特點(diǎn)文獻(xiàn)薈聚分析顯示中國(guó)PGIM以直腸肛管部位最多見(jiàn)(292例，64.74%)，其次為食管(132例，29.27%)、胃、小腸、結(jié)腸等[3]。在本組單中心研究病例中，食管原發(fā)多見(jiàn)(50%，7/14)，其次為直腸肛管(29%，4/14)，可能與文獻(xiàn)中直腸肛管病變報(bào)道多見(jiàn)，而食管部位還未過(guò)多引起臨床關(guān)注有關(guān)。PMME是一種極為罕見(jiàn)的惡性腫瘤，占食管腫瘤的0.1%～0.8%[7]，多見(jiàn)于60歲左右老年人，男性明顯多于女性，90%以上腫物位于食管中下段。在本組PMME病例中，食管中下段最常見(jiàn)，與既往統(tǒng)計(jì)結(jié)果相似[3]，主要表現(xiàn)為進(jìn)食哽噎伴胸骨后或胸背部疼痛，但內(nèi)鏡下僅少數(shù)病例可見(jiàn)色素沉著，這可能是導(dǎo)致誤診的原因之一。PAMM的發(fā)生率占肛門直腸惡性腫瘤的0.05%～4.6%[8]，本組直腸肛管病變多表現(xiàn)為腹痛便血、排便困難，內(nèi)鏡表現(xiàn)以隆起為主，可伴有表面糜爛或污穢，而腫物表面有黑色素沉著有診斷提示意義。胃或小腸黑色素瘤多表現(xiàn)為腹痛，小腸黑色素瘤多為轉(zhuǎn)移性。Sachs等[9]等提出幾條原發(fā)小腸黑色素瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)其他器官原發(fā)灶；病灶單發(fā)；無(wú)引流區(qū)以外的淋巴結(jié)腫大；診斷后存活期1年以上。本組1例小腸病變?yōu)閱伟l(fā)病灶，其他部位未找到原發(fā)灶，且無(wú)淋巴結(jié)腫大，目前已存活23個(gè)月，尚無(wú)復(fù)發(fā)征象，符合原發(fā)的診斷。

分子遺傳學(xué)方面，Lasota等[10]報(bào)道在82%(9/11)的PMME中觀察到IGF1R表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)BRAF突變。最新文獻(xiàn)報(bào)道基于DNA和RNA雜交捕獲的二代測(cè)序分析表明，在10例PMME中，NF1基因突變頻率最高(3/10，30%)，亦未檢測(cè)到BRAF突變[11]。本組病例均未檢測(cè)到BRAF突變，提示分子檢測(cè)BRAF對(duì)于PGIM的輔助診斷價(jià)值有限，但可用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的鑒別診斷。

3.2 病理特征PGIM具有多樣的細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。腫瘤可排列成彌漫實(shí)性片狀、腺泡樣、條索狀、乳頭狀、束狀、血管瘤樣等，瘤細(xì)胞可呈上皮樣、梭形、卵圓形、橫紋肌樣、漿細(xì)胞樣、單核或多核瘤巨細(xì)胞樣等形態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道具有乳頭狀結(jié)構(gòu)的腫瘤的生物學(xué)行為可能預(yù)后較好[11]。PMME的診斷標(biāo)準(zhǔn)要求嚴(yán)格，需具備以下4個(gè)條件[12]：(1)具有典型的黑色素瘤組織學(xué)表現(xiàn)，用特殊染色和免疫組化染色或電鏡證實(shí)瘤細(xì)胞內(nèi)有黑色素顆粒存在；(2)腫瘤起源于食管鱗狀上皮的交界區(qū)；(3)腫瘤附近正常黏膜鱗狀上皮基底含有黑色素顆粒細(xì)胞；(4)排除身體其他部位黑色素瘤轉(zhuǎn)移。本組5例PMME病變中仔細(xì)尋找可見(jiàn)黑色素顆粒，且鱗狀上皮內(nèi)可見(jiàn)黑色素瘤細(xì)胞，即使另外2例上皮內(nèi)未見(jiàn)腫瘤，但病變與鱗狀上皮有明顯的移行。在消化道腫瘤中若出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的多樣性，要考慮該病的可能性，同時(shí)應(yīng)仔細(xì)尋找有無(wú)黑色素顆粒，對(duì)少色素或無(wú)色素顆粒者應(yīng)行免疫組化加以鑒別。常用的特異性標(biāo)志物包括S-100、HMB-45、Mart-1均呈陽(yáng)性，特異性超過(guò)90%。此外，MUM1和vimentin也是較敏感的標(biāo)志物。本組14例中除上述標(biāo)志物陽(yáng)性外，3例同時(shí)表達(dá)CD117，2例同時(shí)表達(dá)CD56，在日常診斷工作中應(yīng)注意與神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的鑒別，避免誤診。

3.3 鑒別診斷(1)上皮樣惡性外周神經(jīng)鞘瘤：S-100強(qiáng)陽(yáng)性，但HMB-45、Mart-1均陰性，伴有EWSR1-ATF1和EWSR1-CREB1融合基因表達(dá)。(2)尤因肉瘤：常發(fā)生在四肢軀干軟組織，腫瘤細(xì)胞CD99胞膜、FLI1、NKX2.2、PAX7和vimentin呈強(qiáng)陽(yáng)性，多數(shù)伴有融合基因EWSR1-FLI1陽(yáng)性。(3)胃腸道惡性神經(jīng)外胚層腫瘤：形態(tài)學(xué)與黑色素瘤有相似之處，呈實(shí)性片狀或巢狀分布，局部排列成假乳頭結(jié)構(gòu)，最具特征的是可見(jiàn)散在破骨樣多核巨細(xì)胞。S-100和vimentin彌漫強(qiáng)陽(yáng)性，CD56、Syn和NSE呈不同程度陽(yáng)性，HMB-45、Mart-1和CD117等均陰性，伴有EWSR1基因重排[13]。(4)胃腸間質(zhì)瘤：CD117、DOG1和CD34呈陽(yáng)性，很少或局灶表達(dá)S-100，約90%病例可檢測(cè)出C-Kit或PDGFRα基因突變，有助于鑒別。

3.4 治療及預(yù)后PAMM和PMME患者的總生存率很低，5年生存率為6%～22%，且對(duì)免疫療法的反應(yīng)較差[14]。本組患者術(shù)后平均生存時(shí)間較短，為11個(gè)月，且病死率很高(78.6%，11/14)。PGIM多采用根治術(shù)治療，少數(shù)輔以化療或免疫生物治療，對(duì)于病變較輕、局限于黏膜固有層者可考慮行內(nèi)鏡下ESD或EMR切除治療。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)15%～20%的黑色素瘤具有較高的C-Kit基因突變，臨床對(duì)于這些攜帶Kit突變基因的患者進(jìn)行靶向治療并有所突破[15-16]。此外，TST26專家小組在黑色素瘤中除檢測(cè)到BRAF和Kit外，亦檢測(cè)到NRAS變異基因，這些發(fā)現(xiàn)可能會(huì)影響到20%的患者治療[17]。目前為止，有研究發(fā)現(xiàn)基因治療可能成為該病的研究方向。

PGIM高度惡性，好發(fā)于食管和直腸肛管，發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期，多伴轉(zhuǎn)移，易被誤診，預(yù)后極差，該病單靠病理檢查很難鑒別原發(fā)與轉(zhuǎn)移，需結(jié)合臨床病史。首次正確診斷對(duì)治療極為重要，內(nèi)鏡表現(xiàn)以隆起型結(jié)節(jié)為主，病理形態(tài)學(xué)及免疫表型有獨(dú)特表現(xiàn)，尤其顯微鏡下腫瘤鄰近上皮基底層見(jiàn)黑色素細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞可見(jiàn)大紅核仁以及混合的上皮樣和梭形細(xì)胞形態(tài)是早期診斷的關(guān)鍵線索，分子遺傳學(xué)方面均未見(jiàn)BRAF V600E突變。