彭煒東，盛有璟，王志皓，肖 寒，程嵐卿，吳 強

肺癌是全球病死率最高的癌癥，5年生存率僅為4%～17%[1]，其中肺腺癌是其最常見的組織學(xué)類型，至今仍無可靠的預(yù)后指標。腫瘤中浸潤的免疫細胞與腫瘤發(fā)展、預(yù)后有著密切聯(lián)系，近年來其作用備受關(guān)注[2]。中性粒細胞作為經(jīng)典的免疫細胞，是人體抵抗感染的第一道防線。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤相關(guān)中性粒細胞(tumor associated neutrophils, TANs)參與了腫瘤的惡性生物學(xué)行為(包括復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移)[3]。研究表明，TANs與乳腺癌的惡性生物學(xué)行為及不良預(yù)后呈正相關(guān)[4-5]?；|(zhì)金屬蛋白水解酶-9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)是鋅離子依賴性蛋白水解酶，參與細胞外基質(zhì)降解的過程，促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[6]。在小鼠乳腺癌模型中，TANs及M2型巨噬細胞的浸潤促進乳腺癌細胞MMP-9高表達，加速腫瘤的惡性進程[7]。本實驗采用免疫組化法檢測肺腺癌組織中TANs的浸潤及MMP-9表達，觀察其與肺腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討其生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014～2017年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院存檔的100例肺腺癌標本，患者手術(shù)前均未接受過任何放、化療等抗癌治療，收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期。所有肺腺癌標本均由兩名病理醫(yī)師重新閱片確診。對患者進行電話隨訪，將手術(shù)時間作為隨訪起始時間，無進展生存期定義為手術(shù)至患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的時間，隨訪截至2021年2月，失訪37例。

1.2 試劑鼠抗人CD66b單克隆抗體(克隆號G10F5，BD Pharmingen公司)，兔抗人MMP-9單克隆抗體(克隆號EP127，北京中杉金橋公司)，小鼠/兔聚合法檢測通用性試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 100例肺腺癌手術(shù)標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE染色和免疫組化EnVision兩步法染色。步驟如下：切片經(jīng)脫蠟水化、高壓修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，滴加一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗，內(nèi)源性過氧化物酶25 ℃封閉30 min。加入小鼠/兔聚合法檢測通用性試劑室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.3.2生物信息學(xué)分析 應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service &cancer=lung)數(shù)據(jù)庫分析MMP-9表達與患者生存預(yù)后的關(guān)系。TIMER(http://cistrome.shinyapps.io/timer)數(shù)據(jù)庫觀察TANs密度與患者生存預(yù)后及其與MMP-9表達的相關(guān)性。

1.4 結(jié)果判讀CD66b以細胞膜和細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色著色為陽性染色，每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，計數(shù)肺腺癌實質(zhì)中浸潤的中性粒細胞數(shù)，避開壞死組織、間質(zhì)組織。以所有病例中TANs密度的中位數(shù)作為區(qū)分高、低密度TANs的指標。MMP-9以細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒視為陽性染色。評分標準[8]：按陽性細胞百分數(shù)評分：無陽性細胞為0分；陽性細胞數(shù)占比<33%為1分，33%～66%為2分，>66%為3分；按染色強弱評分：無染色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：<4分為陰性，≥4分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 6.0.1軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用χ2檢驗，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)檢驗分析相關(guān)性，采用Kaplan-Meier進行生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌中TANs的浸潤情況及其臨床病理特征在肺腺癌的實質(zhì)與間質(zhì)中，均可見TANs浸潤(圖1)。TANs密度與腫瘤分化程度呈負相關(guān)(P<0.05)，與TNM分期呈正相關(guān)(P<0.05)。在實體型和微乳頭型肺腺癌中浸潤的TANs密度較高，在貼壁型肺腺癌中浸潤較少(P<0.05)，TANs密度與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(表1)。Kaplan-Meier生存分析顯示，TANs密度與患者4年無進展生存期呈負相關(guān)(P<0.05，圖2)。

圖1 A.肺腺癌組織中TANs密度低，EnVision兩步法；B.肺腺癌組織中TANs密度高，EnVision兩步法

表1 肺腺癌中TANs及MMP-9表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 肺腺癌中TANs密度與患者4年無進展生存期的關(guān)系

2.2 肺腺癌中MMP-9表達及其與臨床病理特征的關(guān)系MMP-9陽性主要定位于癌細胞胞膜或胞質(zhì)，主要表達于腫瘤細胞，腫瘤間質(zhì)細胞中也可見表達(圖3)。MMP-9表達與肺腺癌分化程度呈負相關(guān)(P<0.05)。在實體型肺腺癌中MMP-9表達較高，在貼壁型肺腺癌中MMP-9表達較少(P<0.05)，MMP-9表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(表1)。Kaplan-Meier生存分析顯示，MMP-9表達與患者4年無進展生存期呈負相關(guān)(P<0.05，圖4)。

圖3 A.肺腺癌組織中MMP-9低表達，EnVision兩步法；B.肺腺癌組織中MMP-9高表達，EnVision兩步法

圖4 肺腺癌中MMP-9表達與患者4年無進展生存期的關(guān)系

2.3 肺腺癌組織中TANs浸潤密度與MMP-9表達的關(guān)系在肺腺癌組織中，TANs浸潤密度與MMP-9表達呈正相關(guān)(r=0.469 3，P<0.05，圖5)。

圖5 肺腺癌組織中TANs與MMP-9蛋白表達的關(guān)系

2.4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析肺腺癌中TANs密度與腫瘤的惡性生物學(xué)的關(guān)系Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫顯示肺腺癌中MMP-9表達與患者的總生存期、首次進展生存期呈負相關(guān)(P<0.05，圖6A、B)。TIMER數(shù)據(jù)庫顯示在肺腺癌組織中，TANs浸潤密度與患者總生存期呈負相關(guān)(圖6C)，且TANs浸潤密度與MMP-9表達密切相關(guān)(P<0.05，圖7)。

圖6 肺腺癌中MMP-9表達及TANs密度與患者預(yù)后的關(guān)系：A.肺腺癌中MMP-9表達與患者總生存期的關(guān)系；B.肺腺癌中MMP-9表達與患者首次進展生存期的關(guān)系；C.TANs密度與患者總生存期的關(guān)系

圖7 TIMER數(shù)據(jù)庫顯示，TANs浸潤與MMP-9表達的關(guān)系:P<0.005

3 討論

中性粒細胞是外周血中最豐富的免疫細胞[9]，是人體抵御感染的首道防線，對各種炎癥信號做出反應(yīng)，在癌癥中亦是如此[10]。近年來，外周血中中性粒細胞與淋巴細胞的比例(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)與患者預(yù)后的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。在黑色素瘤中，NLR與患者無進展生存期及總生存期呈負相關(guān)[11]。在胃癌中，NLR也可用于預(yù)測患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[12]。在非小細胞肺癌中，患者治療前后外周血中較高的NLR與患者較差的生存期及復(fù)發(fā)相關(guān)[13]，均提示NLR與患者的預(yù)后差相關(guān)。然而NLR的檢測可能受多種因素的影響，包括感染、藥物治療及侵入性手術(shù)，因此尋求更加穩(wěn)定的檢測指標十分重要。于是學(xué)者們開始關(guān)注腫瘤中浸潤的中性粒細胞，研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中，CD66b+中性粒細胞浸潤與患者的無進展生存期呈負相關(guān)[14]。在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，腫瘤中浸潤的TANs密度與患者的無進展生存期、總生存期呈負相關(guān)[15]。本組前期實驗發(fā)現(xiàn)，CD66+TANs在乳腺癌中浸潤的密度與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)呈正相關(guān),與患者的無進展生存期呈負相關(guān)[4]。但在肺癌中浸潤的TANs與患者的預(yù)后存在爭議，Eruslanov等[16]的研究結(jié)果顯示，在肺癌中TANs抑制了肺癌的惡性進程。Carus等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中浸潤的中性粒細胞與患者的預(yù)后無明顯相關(guān)性。然而，Rakaee等[18]研究結(jié)果顯示，肺癌中浸潤的TANs與患者生存呈負相關(guān)。為探究TANs與肺癌臨床病理特點及預(yù)后的關(guān)系，本實驗通過免疫組化法觀察TANs在腫瘤內(nèi)的浸潤，分析其與臨床病理之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示肺腺癌中浸潤的TANs密度與腫瘤的分化程度呈負相關(guān)，與TNM分期呈正相關(guān)，與腫瘤的組織學(xué)類型相關(guān)，在實體型、微乳頭型分化較差的肺腺癌中TANs浸潤密度較高，在貼壁型分化較好的肺腺癌中TANs浸潤密度較少，且與患者的4年無進展生存期呈負相關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示TANs浸潤密度與患者總生存期呈負相關(guān)。與Rakaee等研究結(jié)果一致，提示腫瘤組織中浸潤的TANs可用于預(yù)測肺腺癌轉(zhuǎn)移。

關(guān)于TANs促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移機制的研究，本課題組前期觀察到在乳腺癌中，腫瘤細胞可以通過分泌IL-8誘導(dǎo)中性粒細胞捕獲網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)形成，進而促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移，且發(fā)現(xiàn)NETs與患者術(shù)后復(fù)發(fā)呈負相關(guān)[19]。在胃癌中，TANs可以通過分泌IL-17a促進腫瘤細胞的遷移及侵襲能力，且TANs與患者較差的臨床分期及預(yù)后相關(guān)[20]。在胰腺導(dǎo)管癌中，浸潤的TANs與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；細胞學(xué)實驗證明，TANs可以促進腫瘤細胞的侵襲、遷移能力[21]。那么TANs能否通過其他途徑促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移？在本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。在非小細胞肺癌中，MMP-9表達亦與患者的5年生存率呈負相關(guān)，與遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[22]，提示MMP-9與肺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)。那么，在肺癌中TANs與肺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是否由MMP-9介導(dǎo)？為驗證此推測，本實驗利用免疫組化法檢測MMP-9在肺腺癌中的表達并分析其與TANs間的相關(guān)性，結(jié)果顯示MMP-9表達與肺腺癌分化程度呈負相關(guān)，在實體型肺腺癌中MMP-9表達較高，在貼壁型肺腺癌中MMP-9表達較少(P<0.05)。生存分析及生物信息學(xué)分析均提示MMP-9表達與患者無進展生存期呈負相關(guān)(P<0.05)。這與文獻報道結(jié)果一致[14-15]，提示MMP-9與肺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)。接著本實驗通過分析肺腺癌中TANs浸潤密度及MMP-9表達的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)浸潤的TANs與MMP-9表達呈正相關(guān)(P<0.05)；同時通過生物信息學(xué)分析也證實了這一點。這與Nie等[7]在小鼠乳腺癌模型中發(fā)現(xiàn)，TANs浸潤促進乳腺癌細胞MMP-9高表達，加速腫瘤的惡性進程結(jié)果一致。通過本實驗結(jié)果及相關(guān)文獻推測，TANs促進腫瘤細胞表達MMP-9，進而加速肺腺癌細胞的惡性進程。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明TANs及MMP-9表達與肺腺癌的發(fā)展關(guān)系密切，可作為肺腺癌分化、進展和預(yù)后的生物學(xué)標志物。