占蒙娜，于 娟，張小壘，侯英勇

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)都較高，每年約160萬人死于肺癌，其5年生存率約15%[1]。近年來肺癌驅(qū)動基因相關(guān)研究及檢測方法日漸成熟，對肺癌尤其非小細(xì)胞肺癌的靶向治療極其重要。NCCN指南建議具有驅(qū)動基因敏感突變的肺癌患者可使用靶向治療作為一線治療[2]。因此肺癌患者的病理診斷及驅(qū)動基因突變檢測重要且迫切。

常規(guī)的診斷流程需先進(jìn)行石蠟組織包埋切片制備、常規(guī)組織學(xué)病理診斷，再行分子檢測，該流程中基因檢測周期較長。病理醫(yī)師使用快速床旁評估(rapid on site evaluation, ROSE)技術(shù)，可于現(xiàn)場通過細(xì)胞學(xué)診斷向臨床醫(yī)師溝通穿刺操作是否成功，且制作切片和診斷過程中不造成組織標(biāo)本的損失[3-4]，為后續(xù)的基因檢測提供新鮮的標(biāo)本，一定程度上縮短了分子診斷時間，使患者更快得到診療報告從而進(jìn)行后續(xù)治療。本文采用ROSE技術(shù)獲取病理診斷，并評估樣本情況，依據(jù)樣本情況將組織立即送與分子診斷室行肺癌相關(guān)多基因檢測，并將此種方法與常規(guī)流程的檢測周期進(jìn)行對比，探討結(jié)合ROSE評估方法對肺癌基因檢測周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年7月～2020年7月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的肺部占位性質(zhì)不明及部分局部晚期肺癌患者，評估其是否可行支氣管鏡檢查獲取病變組織樣本進(jìn)行基因檢測后，進(jìn)行支氣管鏡采集樣本和ROSE技術(shù)判定病變病理學(xué)類型，標(biāo)本足夠后續(xù)基因檢測者34例，列為ROSE組。其中14例樣本充足的病例同時進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)病理流程送檢，列為常規(guī)組。34例患者臨床病理特征：男性21例，女性13例；年齡>60歲者24例，≤60歲者10例；腫瘤直徑>3 cm者17例，≤3 cm者15例，其中2例腫瘤直徑未知；臨床分期Ⅰ期5例，Ⅱ期1例，Ⅲ期8例，Ⅳ期19例，1例分期未知；34例患者診斷為腺癌18例，鱗狀細(xì)胞癌3例，非小細(xì)胞肺癌3例，低分化癌3例，小細(xì)胞癌1例，轉(zhuǎn)移性低分化癌1例，轉(zhuǎn)移性腺癌5例。

1.2 方法

1.2.1ROSE 經(jīng)纖維支氣管鏡活檢得到的組織涂片2張，其中1張固定染色，由病理科醫(yī)師閱片，給予病理診斷，病理診斷為惡性病變的病例且滿足病理學(xué)評估(腫瘤細(xì)胞≥100個)時，則將另1張涂片上的組織刮取入EP管中，直接進(jìn)行基因檢測。

1.2.2常規(guī)病理流程 14例標(biāo)本組織塊較大，且腫瘤細(xì)胞較豐富，進(jìn)行常規(guī)組織病理送檢，固定、脫水透明、浸蠟包埋，切片染色，病理醫(yī)師進(jìn)行病理診斷，有需要的加做免疫組化明確診斷，標(biāo)本滿足病理學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)者進(jìn)行后續(xù)分子病理基因檢測。病理醫(yī)師采用雙盲法對兩組樣本進(jìn)行病理診斷及基因檢測。

1.2.3核酸抽提 ROSE組34例細(xì)胞學(xué)涂片使用廈門艾德公司的DNA/RNA核酸共提試劑(新鮮組織)提取DNA和RNA。常規(guī)組14例福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本(formalin-fixed and parrffin-embedded, FFPE)使用廈門艾德公司的DNA/RNA核酸共提試劑(FFPE組織)提取DNA和RNA。分別使用nanodrop微量分光光度計測定DNA和RNA的濃度及OD260/280。將抽提的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4基因檢測 ROSE組和常規(guī)組均使用廈門艾德公司的ARMS法多基因突變檢測試劑盒進(jìn)行基因檢測。該試劑盒可檢測EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、NRAS、ERBB2基因熱點突變，c-MET基因14號外顯子跳躍突變以及ALK、ROS1、RET融合基因，具體突變列表見表1、2。具體操作步驟和結(jié)果判讀參考試劑盒說明書進(jìn)行。

表1 ARMS法多基因突變檢測試劑盒具體突變位點：ALK及ROS1

1.2.5檢測周期計算 檢測周期定義為從進(jìn)行纖維支氣管鏡檢查操作，采集臨床標(biāo)本到分子病理檢測報告發(fā)出的工作日。期間應(yīng)包含病理診斷報告的出具，計算每份標(biāo)本的檢測周期。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用t檢驗分析ROSE組和常規(guī)流程組檢測周期的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點ROSE組34例標(biāo)本中，腺癌18例，鱗狀細(xì)胞癌3例，非小細(xì)胞癌-非特殊型3例，低分化癌3例，小細(xì)胞癌1例，轉(zhuǎn)移性腺癌5例，轉(zhuǎn)移性低分化癌1例。常規(guī)流程組14例標(biāo)本的病理診斷和ROSE診斷結(jié)果一致。

2.2 基因檢測ROSE組34例標(biāo)本中EGFR基因突變20例，其中19號外顯子突變13例，21號外顯子L858突變5例、L861Q突變1例，18號外顯子G719X突變1例；KRAS基因突變2例，未檢出突變12例(圖1)。常規(guī)組14例標(biāo)本中EGFR基因突變9例，其中19號外顯子突變6例，21號外顯子L858突變2例、L861Q突變1例；KARS基因突變1例，未檢出突變4例。兩組結(jié)果比較，ROSE組的檢測結(jié)果與常規(guī)組一致，突變基因檢測符合率達(dá)100%，且突變位點的符合率也達(dá)100%。

表2 ARMS法多基因突變檢測試劑盒具體突變位點：EGFR、KRAS及BRAF

圖1 ROSE組檢測到基因突變

2.3 檢測周期ROSE組34例基因檢測周期為0.19～6.22天，平均2.84天，常規(guī)組檢測周期為3.00～15.03天，平均7.89天，兩組檢測周期差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1，圖2)。其中ROSE組中有5例最終報告檢測周期小于24 h，而常規(guī)組檢測周期最長者需要15天。

圖2 ROSE組基因檢測周期顯著低于常規(guī)組

3 討論

肺癌進(jìn)展迅速，約70%非小細(xì)胞肺癌患者在首次診斷時已處于進(jìn)展期，喪失了手術(shù)機(jī)會，預(yù)后差，病死率高[5-6]。對于晚期患者常采用穿刺等介入檢查手段進(jìn)行病理診斷和后續(xù)基因檢測，進(jìn)而及時進(jìn)行靶向治療。因此介入檢查后的病理診斷及基因檢測周期的優(yōu)化十分重要。常規(guī)診療模式是首先進(jìn)行常規(guī)病理診斷，再行分子病理檢測?；驒z測周期過長，臨床診療的效率較低。此時，分子病理診斷與常規(guī)病理診斷具備同等重要的價值，對于基因檢測周期的進(jìn)一步優(yōu)化顯得尤為重要[7]。

本實驗采用ROSE技術(shù)收集新鮮組織樣本，并通過ARMS法多基因檢測進(jìn)行肺癌標(biāo)本病理診斷和基因檢測的優(yōu)化路徑，優(yōu)化后的檢測路徑平均檢測周期顯著少于常規(guī)檢測路徑。美國病理學(xué)會等分子病理基因檢測指南建議基因檢測周期應(yīng)≤10天[8]，該綜合手段的應(yīng)用使得檢測周期遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于指南建議的時間。本組還探討ROSE技術(shù)下病理診斷的準(zhǔn)確性、樣本的核酸質(zhì)量和ARMS法多基因檢測的實際臨床應(yīng)用價值，確保新檢測路徑下肺癌標(biāo)本病理診斷和基因檢測及時、準(zhǔn)確而又全面。

本組還選取14例同時進(jìn)行ROSE優(yōu)化路徑和常規(guī)路徑檢測的樣本，結(jié)果顯示其具有完全一致的病理診斷和基因檢測結(jié)果，證實ROSE技術(shù)可以得出可靠的病理診斷結(jié)果。ROSE取得的樣本為新鮮組織，提取的DNA和RNA質(zhì)量均較好，所以分子病理結(jié)果也和常規(guī)路徑一致。既往文獻(xiàn)中亦證實ROSE技術(shù)對常規(guī)病理診斷無明顯負(fù)面影響，而有利于及時對標(biāo)本進(jìn)行腫瘤細(xì)胞評估，減少穿刺次數(shù)，也為后續(xù)的分子病理檢測提供便利[4,9]。值得一提的是，新鮮組織RNA質(zhì)量優(yōu)于石蠟包埋組織，在檢測融合基因和跳躍突變方面具有更明顯的優(yōu)勢，但本組病例數(shù)較少，尚未表現(xiàn)出這種差異。隨著該優(yōu)化檢測路徑后續(xù)的廣泛應(yīng)用，通過收集更多的數(shù)據(jù)，將會證實新路徑在融合基因檢測方面的優(yōu)勢。

本組優(yōu)化后路徑平均檢測周期為2.84天，顯著少于常規(guī)檢測路徑的7.89天。日前，我國有學(xué)者在單中心研究中，經(jīng)過優(yōu)化將肺癌診斷和基因檢測時間縮短為平均4天(3～6天)[10]。本組經(jīng)過優(yōu)化，檢測周期進(jìn)一步縮短，具有普遍推廣價值。

本組中使用的ARMS法多基因檢測試劑盒囊括肺癌相關(guān)多個基因和靶向治療相關(guān)的熱點驅(qū)動基因突變，ARMS法操作及結(jié)果判讀簡易，與單基因檢測以及二代測序相比，該檢測方法快速且全面，可對初治患者和耐藥突變患者進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測，更適合于規(guī)范的優(yōu)化路徑使用。

總之，本組綜合運用ROSE技術(shù)和ARMS法多基因檢測技術(shù)，將肺癌病理診斷和分子病理基因檢測平均周期縮短為3天內(nèi)，且證實該路徑中病理診斷和基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以大幅提高肺癌患者的診療速度，為患者選擇更好的診療策略提供保障。