葉 偉，徐建平，宋蓉蓉，趙潔婷，李會方，史先鋒，孟 剛

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，且其發(fā)病率逐年增高，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占85%，其5年生存率僅為16%[1]。對于沒有驅(qū)動基因改變的晚期NSCLC患者的治療方案有限。近年來，免疫療法被證明比傳統(tǒng)的治療方法更有效，2016年美國食品藥物管理局(food and drug administration, FDA)批準帕博利珠單抗(pembrolizumab)作為晚期PD-L1高表達(TPS≥50%)NSCLC患者的一線治療方案，并作為于鉑類化療治療后出現(xiàn)疾病進展的患者和PD-L1(TPS≥1%)NSCLC患者的二線治療推薦[2-4]。由于很多晚期患者已不適合行手術(shù)切除[5]，而病理診斷和免疫組化檢測通常只能依賴于CT引導(dǎo)下肺穿刺和經(jīng)支氣管鏡的小活檢組織標本以及經(jīng)支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下(endobronchial ultrasound, EBUS)細針穿刺(transbronchial needle aspiration, TBNA)和漿膜腔積液穿刺的細胞學(xué)標本。本文旨在探討PD-L1在NSCLC小活檢與手術(shù)標本以及細胞學(xué)與組織學(xué)標本中表達的一致性，以期了解小活檢及細胞學(xué)標本在PD-L1檢測中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集安徽省胸科醫(yī)院2019年1月～2020年8月766例病理診斷明確的NSCLC標本。其中男性535例，女性231例；年齡29～90歲，中位年齡69歲；標本類型：手術(shù)標本200例，氣管鏡活檢219例，肺穿刺活檢195例，EBUS-TBNA細胞塊69例，漿膜腔積液包埋細胞塊83例；標本來源：肺619例，淋巴結(jié)60例，胸腔積液79例，心包積液4例，胸壁3例，胸膜1例。

1.2 標本制備活檢組織標本取出后立即用10%中性福爾馬林固定，手術(shù)切除組織標本離體后0.5 h內(nèi)經(jīng)10%中性福爾馬林固定，完成取材后將樣本轉(zhuǎn)移至Lecia-ASP300S全封閉組織處理器中進行脫水，后進行石蠟包埋、切片。細胞學(xué)標本：(1)EBUS-TBNA細胞塊，標本取出后置于10 mL生理鹽水中，自然沉淀形成固形物后經(jīng)漏斗狀包埋紙過濾掉液體成分，放入10%中性福爾馬林中固定，后處理程序與組織學(xué)標本一致；(2)胸水包埋細胞塊，將200～800 mL新鮮胸腔積液1 600 r/min離心5 min，倒去上清液，余下標本中加入95%乙醇振蕩至少15 min，再次經(jīng)1 600 r/min離心3 min，靜止3 h以上直至細胞團變硬和收縮，將成型良好的細胞塊放入10%中性福爾馬林中固定，后處理程序與組織學(xué)標本一致。所有組織學(xué)和細胞學(xué)標本均采用WHO(2015)肺腫瘤分類標準進行病理診斷，必要時行TTF-1、Napsin A、p40、Syn、CgA等免疫組化標記以確定NSCLC的診斷，腫瘤細胞數(shù)≤100個的病例被排除。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用EnVision兩步法。所有標本完成脫水后石蠟包埋、切片、染色，在帶正電荷玻片上連續(xù)4 μm厚切片，脫蠟后，打開DAKO Autostainer Link48軟件平臺，打印并粘貼標簽，放入PT-Link修復(fù)儀中進行抗原修復(fù)(pH 6.0檸檬酸修復(fù)液，97 ℃ 25 min)，上機滴加PD-L1單克隆抗體(22C3，濃縮液，1 ∶50稀釋)20 ℃孵育40 min，余流程如下：Buffer沖洗，EnV FLEX+Mouse LINKER 30 min，Buffer沖洗，EnV FLEX/HRP 30 min，Buffer沖洗，Buffer 5 min，F(xiàn)LEX DAB+Sub-Chromo 10 min，Buffer沖洗，DAB Enhance 5 min，Buffer沖洗，DI Water沖洗，復(fù)染蘇木精、脫水、透明、中性樹膠封固；以正常扁桃體為陽性對照，以無原發(fā)性抗原的NSCLC標本為陰性對照。

1.4 結(jié)果判讀PD-L1表達評分由專業(yè)病理學(xué)家采用雙盲法判讀；部分或完全的細胞膜呈PD-L1染色的腫瘤細胞為陽性細胞；細胞質(zhì)染色不能定義為陽性，腫瘤相關(guān)免疫細胞(淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞漿細胞、中性粒細胞)的所有染色以及腫瘤細胞相鄰的間質(zhì)細胞、壞死細胞以及沉著的炭末著色均定義為陰性；未納入評價的免疫細胞PD-L1表達可作為陽性內(nèi)對照。使用腫瘤細胞陽性細胞比率，即TPS評分(任何強度的部分或完全胞膜染色的活腫瘤細胞占標本中所有的活腫瘤細胞的百分比)進行PD-L1表達分類：TPS≥50%為高表達組，1%～49%為低表達組，<1%為無表達組[2-3]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以頻數(shù)(例)和百分比(%)表示；組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行統(tǒng)計分析。采用Kappa一致性檢驗比較多種方法結(jié)果的一致性，一般認為當Kappa≥0.75時，表明兩者一致性較好；0.4≤Kappa<0.75時，表明一致性適中；Kappa<0.4時，表明兩者一致性較差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC中PD-L1表達與臨床病理特征的關(guān)系臨床病理資料顯示，PD-L1 TPS≥50%和TPS<50%兩組間性別、腫瘤類型、標本類型、pTNM分期、標本來源差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 非小細胞肺癌中PD-L1表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 配對的小活檢和手術(shù)標本中PD-L1的表達手術(shù)標本陽性被認為是真陽性。當以TPS≥50%為閾值評估腫瘤組織中PD-L1表達時，80.8%(59/73)的小活檢和手術(shù)標本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.483，P<0.001)，檢測的敏感性為43.5%，特異性為98.0%(圖1)，其中14例不一致病例中有13例為假陰性，1例為假陽性(表2)。當以TPS≥1%為閾值時，80.8%(59/73)的小活檢和手術(shù)標本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.618，P<0.001)，檢測的敏感性為73.9%，特異性為92.6%，其中14例不一致病例中有12例為假陰性，2例為假陽性(表3)。

圖1 PD-L1在配對小活檢標本和手術(shù)標本中的表達，EnVision兩步法：A.右上肺支氣管鏡活檢，TPS：95%；B.患者5天后行右上肺葉手術(shù)切除，TPS：90% 圖2 配對EBUS-TBNA細胞塊和組織學(xué)樣本中PD-L1的表達，EnVision兩步法：A.第7組淋巴結(jié)EBUS-TBNA細胞塊，TPS：90%；B.患者同時行左下肺氣管鏡活檢，TPS：80% 圖3 配對漿膜腔積液細胞塊和組織學(xué)樣本中PD-L1的表達，EnVision兩步法：A.右側(cè)胸水包埋細胞塊，TPS：60%；B.患者3天后行肺穿刺活檢，TPS：80%

表2 使用閾值TPS≥50%分析PD-L1在小活檢和手術(shù)標本中表達的一致性

表3 使用閾值TPS≥1%分析PD-L1在小活檢和手術(shù)標本中表達的一致性

2.3 配對的EBUS-TBNA細胞塊和組織學(xué)樣本中PD-L1的表達組織學(xué)標本陽性被認為是真陽性。當以TPS≥50%為閾值評估腫瘤組織中PD-L1的表達時，86.9%(20/23)的EBUS-TBNA細胞學(xué)塊和組織學(xué)標本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.679，P<0.05)，敏感性為71.4%，特異性為93.8%(圖2)，3例不一致病例中有2例為假陰性，1例為假陽性(表4)。當以TPS≥1%為閾值時，91.3%(21/23)的EBUS-TBNA細胞塊和組織學(xué)標本結(jié)果一致，一致性較好(Kappa=0.795，P<0.001)，敏感性為93.8%，特異性為85.7%，2例不一致病例中有1例為假陰性，1例為假陽性(表5)。

表4 使用閾值TPS≥50%分析PD-L1在EBUS-TBNA細胞塊和組織學(xué)標本中表達的一致性

表5 使用閾值TPS≥1%分析PD-L1在EBUS-TBNA細胞塊和組織學(xué)標本中表達的一致性

2.4 配對的漿膜腔積液細胞塊和組織學(xué)樣本PD-L1的表達組織學(xué)標本陽性被認為是真陽性。當以TPS≥50%為閾值評估腫瘤組織中PD-L1表達時，85.3%(29/34)的漿膜腔積液細胞塊和組織學(xué)標本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.465，P<0.05)，敏感性為42.9%，特異性為96.3%(圖3)，5例不一致病例中有4例為假陰性(表6)；當以TPS≥1%為閾值時，58.8%(29/34)的漿膜腔積液細胞塊和組織學(xué)標本結(jié)果一致，一致性較差(Kappa=0.176，P>0.05)，敏感性為57.1%，特異性為61.5%，14例不一致病例中有9例假陰性，5例假陽性(表7)。

表6 使用閾值TPS≥50%分析PD-L1在漿膜腔積液細胞塊和組織學(xué)標本中表達的一致性

表7 使用閾值TPS≥1%分析PD-L1在漿膜腔積液細胞塊和組織學(xué)標本中表達的一致性

3 討論

PD-L1作為晚期NSCLC免疫治療療效預(yù)測的生物標志物之一，其表達在應(yīng)用免疫檢查點抑制劑治療前選擇優(yōu)勢人群中有重要意義。但PD-L1表達狀態(tài)與各臨床病理因素的關(guān)系常常會出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果[6-9]，其主要原因可能為：所使用的PD-L1抗體以及染色評估方法不同，并且Ⅱ期藍印計劃[10]發(fā)現(xiàn)28-8、22C3、SP263對腫瘤細胞染色的一致性較高，而SP142等其他抗體間的一致性低。本實驗結(jié)果顯示PD-L1表達與患者年齡無相關(guān)性，而PD-L1在男性患者、鱗狀細胞癌、晚期患者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達較高，并且在不同類型標本之間的表達存在差異，這與Zhang等[7]的研究結(jié)果相似，提示腫瘤進展因素傾向于PD-L1表達增加，也進一步驗證PD-L1高表達是NSCLC預(yù)后不良的因素[8]。

小活檢組織是獲取腫瘤生物學(xué)信息的重要手段，這些信息可以定義和確定NSCLC的治療策略，小活檢標本的獲取通常先于手術(shù)標本，而其PD-L1檢測結(jié)果的準確性受諸多因素的影響：腫瘤的異質(zhì)性[11]，病理醫(yī)師判讀時的主觀性[7]，期間放、化療和靶向治療對于PD-L1表達的調(diào)節(jié)作用[12]等；并且有研究認為免疫介導(dǎo)的細胞殺傷可能在治療中起作用，而上調(diào)PD-L1表達可使癌細胞逃避免疫介導(dǎo)的細胞殺傷作用[13]。本組結(jié)果顯示，在配對的小活檢和手術(shù)標本中，無論以TPS≥50%還是≥1%為閾值評估PD-L1表達時，兩者的一致性均為80.8%，這與既往的研究結(jié)果相似[14]。另一項研究[15]發(fā)現(xiàn)當以TPS≥50%為閾值時，兩者一致性為92.2%，當以≥1%為閾值時，一致性為76.7%；以上結(jié)果均表明小活檢是可以替代手術(shù)標本完成PD-L1檢測。同時，進一步分析可以發(fā)現(xiàn)在所有不一致病例中假陰性率非常高，而有學(xué)者認為盡可能多的取材(至少4個活檢標本)以及病理學(xué)家PD-L1判讀前的專業(yè)培訓(xùn)會增加小活檢PD-L1檢測的準確性[16-17]。

由于晚期NSCLC患者耐受能力差，細胞學(xué)標本可能是唯一能夠獲取的標本[18]。EBUS-TBNA是一種安全、微創(chuàng)的肺、縱隔以及肺門淋巴結(jié)明確診斷和分期技術(shù)[19]，其取材方式并非從單個固定部位提取組織，而是采用來回運動反復(fù)吸取，其實是一種動態(tài)過程，因此更易獲取到更廣泛的區(qū)域，更接近腫瘤組織的真實狀態(tài)；但腫瘤細胞數(shù)目則是影響PD-L1檢測結(jié)果準確性的重要因素[20]。本組實驗數(shù)據(jù)顯示EBUS-TBNA細胞學(xué)標本中PD-L1高表達率為34.8%，這可能與細胞學(xué)標本患者的腫瘤分期較晚有一定關(guān)系，而分期較晚PD-L1更易高表達[7-8,21]。此外，Sakata等[22]在對配對的EBUS-TBNA細胞學(xué)與組織學(xué)標本PD-L1表達進行研究時發(fā)現(xiàn)，以TPS≥50%為閾值時，兩者的一致性為82%，當以≥1%為閾值時，一致性為87%；Skov等[23]的研究結(jié)果顯示，以TPS≥50%為閾值時的一致性為94%，以≥1%為閾值時的一致性為85%。本組實驗結(jié)果與其相似，以TPS≥50%為閾值時的一致性為87%，當以≥1%為閾值時的一致性為91%；由此可認為EBUS-TBNA細胞塊可以替代組織學(xué)標本完成PD-L1檢測。

雖然漿膜腔積液細胞塊在病理診斷及靶向基因檢測上的可行性已得到證實[24]，但在PD-L1表達的問題上尚未得到統(tǒng)一認識，不同的實驗室在制備細胞塊過程中固定劑的選擇、固定時間和制備方法差異明顯[25]。本組數(shù)據(jù)顯示PD-L1高表達率為9.6%，而既往研究結(jié)果不盡相同[26-27]。相關(guān)研究表明：細胞學(xué)標本中用乙醇固定可引起PD-L1免疫反應(yīng)性降低，并可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果[28]；而另一項研究則表明不同的固定劑對PD-L1表達的評估無顯著影響[29]。Grosu等[30]對應(yīng)用10%中性福爾馬林固定的漿膜腔積液細胞塊與配對的組織學(xué)標本進行研究時發(fā)現(xiàn)，兩者的總體一致性為78%，當以≥1%為閾值時的一致性為87.0%。本組結(jié)果與其不完全一致，顯示當以≥50%為閾值時兩者的一致性為85.3%；當以≥1%為閾值時，一致性下降為58.8%，提示采用較低閾值(TPS≥1%)評估時，其可能會錯誤的分類PD-L1表達狀況。分析其主要原因可能與95%乙醇固定相關(guān)，而關(guān)于細胞學(xué)標本的乙醇前固定以及固定時間長短對PD-L1表達的具體影響仍有待于深入分析。

綜上所述，PD-L1免疫組化在NSCLC小活檢、EBUS-TBNA細胞塊以及以高閾值(TPS≥50%)評估的漿膜腔積液細胞塊標本中的檢測結(jié)果是可靠的，可作為免疫治療的循證學(xué)依據(jù)；然而在采用較低閾值(TPS≥1%)評估時，漿膜腔積液細胞塊標本可能會錯誤的分類PD-L1表達，此時可能需要謹慎的重復(fù)評估。