DNA倍體分析聯(lián)合HPV-DNA 23分型檢測(cè)對(duì)ASC-US的診斷價(jià)值

孫春杰，余小蒙，張欣榮，岳 欣，劉明依，任雨桐

液基細(xì)胞涂片(liquid-based preparation, LBP)是子宮頸病變最常見(jiàn)篩查方法。細(xì)胞學(xué)報(bào)告“不能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells -of undetermined significance, ASC-US)”，已成為子宮頸細(xì)胞學(xué)診斷及臨床處理過(guò)程中的難點(diǎn)[1-2]，且與陰道鏡下病理活檢結(jié)果差異較大。ASC-US組織病理學(xué)結(jié)果可能出現(xiàn)在良性改變、癌前病變及早期浸潤(rùn)癌大跨度之間，存在低診、過(guò)診或漏診風(fēng)險(xiǎn)。目前推薦HPV-DNA 23分型檢測(cè)(HPV檢測(cè))，其敏感度高，對(duì)防止漏診很有效，但特異度偏低，會(huì)產(chǎn)生過(guò)診、過(guò)治傾向。因此，對(duì)ASC-US分流一直存在爭(zhēng)議。本文選取64例LBP篩查報(bào)告為ASC-US標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行DNA倍體分析、HPV檢測(cè)及子宮頸活檢組織病理檢查，旨在探討DNA倍體分析、HPV檢測(cè)在ASC-US分流中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年1～11月北京市通州區(qū)婦幼保健院收治的64例ASC-US子宮頸活檢組織，患者年齡23～66歲，平均(39.59±11.45)歲。

1.2 方法

1.2.1LBP檢查及DNA倍體分析檢測(cè) 采用子宮頸刷刷取子宮頸細(xì)胞樣本，制成LBP薄片2張，1張用于巴氏染色進(jìn)行LBP TBS分級(jí)診斷，1張用于Feulgen染色進(jìn)行DNA倍體分析，采用全自動(dòng)細(xì)胞腫瘤篩查分析系統(tǒng)-SPICM-DNA(武漢呵爾醫(yī)療公司)。LBP診斷標(biāo)準(zhǔn)采用Bethesda分級(jí)系統(tǒng)，分為正常和非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells, ASC)，后者包括ASC-US和不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion, ASC-H)、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)和子宮頸癌。DNA倍體分析根據(jù)DI值及異常細(xì)胞數(shù)分為[3-4]：DI<2.5的細(xì)胞為正常，1～2年后復(fù)查；2.5≤DI<4.5，<3個(gè)細(xì)胞，4～6個(gè)月復(fù)查；2.5≤DI<4.5，≥3個(gè)細(xì)胞，陰道鏡活檢；DI≥4.5，異倍體細(xì)胞單個(gè)或多個(gè)，陰道鏡活檢。DNA倍體分析異常指DI≥2.5，凡DI≥2.5的細(xì)胞玻片都要排除分析系統(tǒng)將雜質(zhì)和重疊細(xì)胞核誤認(rèn)為癌細(xì)胞或異常細(xì)胞。

1.2.2HPV檢測(cè) 采用分子倒流雜交技術(shù)(廣州凱普生物公司)，為23種分型，其中包括17種高危型和6種低危型，擬定檢出純高危型為陽(yáng)性。

1.2.3活檢標(biāo)本獲得 采用陰道鏡(北京四維賽洋公司)檢查并取活檢。按照WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)將病理結(jié)果分為正?；蜓装Y、子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)1、CIN2、CIN3和子宮頸癌五種類(lèi)型，其中CIN1為L(zhǎng)SIL，CIN2、CIN3為HSIL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)資料性質(zhì)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織活檢64例ASC-US活檢病例中，42例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為65.63%(42/64)；其中LSIL 21例，占比32.81%(21/64)，HSIL+癌21例(包括鱗狀細(xì)胞癌1例)，占比32.81%(21/64)。正?；蜓装Y22例，占比34.38%(22/64)。

2.2 不同子宮頸組織中DNA倍體分析64例ASC-US的DNA倍體分析結(jié)果顯示：陰性24例，包括9例正?；蜓装Y：例1 DI為2.059～1.205，DNA倍體分析結(jié)果提示為正常(圖1A)，組織學(xué)顯示部分柱狀上皮下有鱗狀上皮化生(圖1B)，LBP顯示一小群修復(fù)細(xì)胞具有鱗狀化生細(xì)胞外形，胞質(zhì)較少、細(xì)胞核增大及有小核仁(圖1C)；10例LSIL，5例HSIL。陽(yáng)性40例，包括13例正常或炎癥；11例LSIL：例2 DNA檢測(cè)結(jié)果提示DI>2.5的倍體異常細(xì)胞超過(guò)3個(gè)為檢測(cè)陽(yáng)性(圖2A)，組織學(xué)顯示子宮頸上皮基底層局灶細(xì)胞異型性明顯，極向紊亂，范圍位于子宮頸上皮層下1/3，棘細(xì)胞層可見(jiàn)許多挖空細(xì)胞，提示HPV感染(圖2B)，其中可見(jiàn)少量細(xì)胞核輕度增大及核深染的非典型鱗狀細(xì)胞。巴氏染色顯示僅見(jiàn)1個(gè)挖空樣細(xì)胞，核增大程度不足以判讀LSIL(圖2C)；16例HSIL+癌：例3 DNA檢測(cè)結(jié)果提示DI>2.5的倍體異常細(xì)胞超過(guò)3個(gè)為檢測(cè)陽(yáng)性，并且異常程度較例2更嚴(yán)重(圖3A)，組織學(xué)顯示腫瘤細(xì)胞具有明顯異型性，范圍超過(guò)子宮頸上皮2/3，但未突破基膜(圖3B)，巴氏染色可見(jiàn)數(shù)個(gè)細(xì)胞核輕度增大及核深染的非典型鱗狀細(xì)胞，不足以判讀為鱗狀上皮內(nèi)病變(表1，圖3C)。

圖1 例1：A.慢性子宮頸炎DNA倍體分析報(bào)告：所有前25位的細(xì)胞核DI介于2.059～1.205；B.慢性子宮頸炎組織切片HE染色：子宮頸表面被覆一層柱狀上皮，部分柱狀上皮下有鱗狀上皮化生，在宮頸上皮下層可見(jiàn)毛細(xì)血管增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；C.ASC-US沉降式液基涂片：慢性子宮頸炎伴有反應(yīng)性修復(fù)性改變，圖中央可見(jiàn)一小群修復(fù)細(xì)胞具有鱗狀化生細(xì)胞外形，胞質(zhì)較少、細(xì)胞核增大及有小核仁；背景中可見(jiàn)多個(gè)表層、中層鱗狀細(xì)胞及大量中性粒細(xì)胞，巴氏染色 圖2 例2：A.CIN1 DNA倍體分析報(bào)告：前15位的細(xì)胞核DI介于4.792～2.503；B.CIN1組織切片HE染色：子宮頸上皮基底層局灶細(xì)胞異型性明顯，極向紊亂，范圍位于子宮頸上皮層下1/3；C.ASC-US沉降式液基涂片：可見(jiàn)大量表層及中層多邊形正常鱗狀細(xì)胞，其中可見(jiàn)少量細(xì)胞核輕度增大及核深染的非典型鱗狀細(xì)胞位于圖左上方及中央偏右處，僅見(jiàn)一個(gè)挖空樣細(xì)胞，巴氏染色 圖3 例3：A.CIN3 DNA倍體分析報(bào)告：前25位的細(xì)胞核DI介于9.194～3.378；B.CIN3組織切片HE染色：腫瘤細(xì)胞具有明顯異型性，范圍超過(guò)子宮頸上皮2/3以上，但未突破基膜；C.ASC-US沉降式液基涂片：可見(jiàn)數(shù)個(gè)細(xì)胞核輕度增大及核深染的非典型鱗狀細(xì)胞；周?chē)梢?jiàn)數(shù)個(gè)大多邊形的表層、中層鱗狀細(xì)胞，巴氏染色

表1 DNA倍體分析在不同子宮頸組織中的表達(dá)

2.3 不同子宮頸組織中HPV檢測(cè)64例ASC-US的HPV檢測(cè)結(jié)果顯示：陰性17例，包括12例正?；蜓装Y，4例LSIL，1例HSIL；陽(yáng)性47例，包括10例正?；蜓装Y，17例LSIL，20例HSIL+癌；HPV陽(yáng)性檢出率在正?；蜓装Y、LSIL、HSIL+癌中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.556，P=0.001，表2)。進(jìn)一步比較正?；蜓装Y與HSIL+癌中HPV陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.625，P<0.001)。

表2 HPV在不同子宮頸組織中的表達(dá)

2.4 ASC-US活檢陽(yáng)性患者中DNA倍體分析與HPV檢測(cè)的相關(guān)性在42例活檢陽(yáng)性病例中，DNA倍體分析陽(yáng)性27例，包括11例LSIL，對(duì)應(yīng)HPV陽(yáng)性7例，HPV陰性4例；16例HSIL+癌，對(duì)應(yīng)HPV陽(yáng)性15例，HPV陰性1例；DNA倍體分析陰性15例，包括10例LSIL，對(duì)應(yīng)HPV陽(yáng)性10例；5例HSIL+癌，對(duì)應(yīng)HPV陽(yáng)性5例。

在42例活檢陽(yáng)性病例中，HPV陽(yáng)性37例，包括17例LSIL，對(duì)應(yīng)DNA倍體分析陽(yáng)性7例，DNA倍體分析陰性10例；20例HSIL+癌，對(duì)應(yīng)DNA倍體分析陽(yáng)性15例，DNA倍體分析陰性5例。HPV檢出陰性5例，包括4例LSIL，對(duì)應(yīng)DNA倍體分析陽(yáng)性4例；1例HSIL+癌，對(duì)應(yīng)DNA倍體分析陽(yáng)性1例(表3)。

表3 ASC-US活檢陽(yáng)性病例中DNA倍體分析與HPV檢測(cè)的相關(guān)性

DNA倍體分析陽(yáng)性27例，占比陽(yáng)性病例64.29%，HPV陽(yáng)性37例，占比陽(yáng)性病例88.10%。DNA倍體分析+HPV共陽(yáng)性22例，占比34.38%(22/64)，DNA倍體分析或HPV陽(yáng)性20例，占比31.25%(20/64)。

2.5 ASC-US中DNA倍體分析及HPV檢測(cè)在42例活檢陽(yáng)性病例中，LSIL 21例，其DNA倍體分析+HPV共陽(yáng)性7例，DNA倍體分析陽(yáng)性4例，HPV陽(yáng)性10例；HSIL+癌21例，其DNA倍體分析+HPV共陽(yáng)性15例，DNA倍體分析陽(yáng)性1例，HPV陽(yáng)性5例，DNA倍體分析或HPV陽(yáng)性占比9.38%(6/64)。

22例活檢陰性病例中：DNA倍體分析+HPV共陽(yáng)性占比6.25%(4/64)，DNA倍體分析或HPV陽(yáng)性占比23.44%(15/64)，DNA倍體分析+HPV共陰性3例，占比4.69%(3/64)(表4)。

表4 ASC-US中DNA倍體分析及HPV檢測(cè)

3 討論

3.1 子宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的意義二十世紀(jì)40年代巴氏細(xì)胞涂片篩查的開(kāi)展，降低了子宮頸癌的發(fā)病率和病死率。子宮頸LBP是閱片醫(yī)師在顯微鏡下觀察細(xì)胞大小及形態(tài)等做出診斷，可能因醫(yī)師主觀性及視覺(jué)疲勞等原因出現(xiàn)假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果。尤其對(duì)于ASC-US，在不足以診斷LSIL時(shí)，其病理結(jié)果既可以為正?；蜓装Y，也可能是LSIL、HSIL，甚至癌。因此，單純依靠細(xì)胞學(xué)篩查子宮頸病變存在明顯不足。

3.2 HPV檢測(cè)的價(jià)值高危型HPV持續(xù)感染是目前唯一明確的子宮頸癌病因，而慢性感染、性傳播疾病、吸煙等為協(xié)同因素[5-6]。HPV分型檢測(cè)旨在對(duì)子宮頸早期病變進(jìn)行及時(shí)跟蹤及輔助診斷，從而作為細(xì)胞發(fā)生高級(jí)別病變的重要信號(hào)[7]。但該檢測(cè)也存在不足，一旦細(xì)胞感染高危型HPV，無(wú)論處于什么階段，是一過(guò)性還是攜帶者，檢測(cè)結(jié)果均顯示陽(yáng)性，80%～90%的感染者經(jīng)過(guò)1年可通過(guò)自身免疫力清除病毒。因此，單純依靠HPV檢測(cè)結(jié)果，可能造成臨床過(guò)度干預(yù)及治療。

3.3 DNA倍體分析檢測(cè)的意義近20年來(lái)，DNA倍體分析在我國(guó)子宮頸病變篩查中得到應(yīng)用。DNA異倍體系遺傳基因變異所致，是腫瘤細(xì)胞形成過(guò)程中的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)記[8]。當(dāng)子宮頸病變級(jí)別逐漸升高時(shí)，子宮頸細(xì)胞異常增殖亦逐漸增加，導(dǎo)致細(xì)胞核DNA結(jié)構(gòu)及數(shù)量發(fā)生變化[9]。因此，借助對(duì)細(xì)胞DNA含量的定量分析，可以為細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)估腫瘤生物學(xué)特征提供有價(jià)值的補(bǔ)充，對(duì)提高子宮頸病變的陽(yáng)性檢出率，為臨床及早干預(yù)提供依據(jù)。

遵循NCCN子宮頸癌篩查指南制定ASC-US的處理方式[10]，本組ASC-US陰道鏡活檢組織結(jié)果顯示，慢性子宮頸炎占34.38%，LSIL占比32.81%，HSIL占比31.25%，子宮頸癌占比1.56%。劉霞等[11]研究顯示，ASC-US中炎癥占比41.02%，CIN1占比29.39%，CIN2、3占比23.27%，子宮頸癌占比6.33%，與本組相近。因此，ASC-US患者進(jìn)行4～6個(gè)月隨訪，可能會(huì)漏掉部分HSIL甚至癌的病例。

本組證實(shí)，HPV陽(yáng)性檢出率在正?；蜓装Y、LSIL、HSIL+癌中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.556，P=0.001)，進(jìn)一步比較正?；蜓装Y與HSIL+癌中差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.625，P<0.001)，提示在HSIL+癌與HPV感染關(guān)系更密切。本組ASC-US活檢病理結(jié)果陽(yáng)性LSIL、HSIL+癌中，其DNA倍體分析陽(yáng)性時(shí)，HPV陽(yáng)性或陰性；其DNA倍體分析陰性時(shí)，HPV均為陽(yáng)性；同理，其HPV陽(yáng)性時(shí)，DNA倍體分析陽(yáng)性或陰性；其HPV陰性時(shí)，DNA倍體分析均為陽(yáng)性。本組提示在LBP報(bào)告ASC-US時(shí)，DNA倍體分析和(或)HPV陽(yáng)性，應(yīng)轉(zhuǎn)診陰道鏡，否則可能漏掉HSIL，甚至癌；但對(duì)于ASC-US病理結(jié)果陰性時(shí)，HPV和(或)DNA倍體分析陽(yáng)性可能存在過(guò)度干預(yù)，但相較于陽(yáng)性病變中相應(yīng)占比和病變程度可以忽略；HPV及DNA倍體分析均陰性時(shí)常規(guī)LBP隨診即可。

本組結(jié)果顯示：(1)在活檢病理陽(yáng)性病例中，DNA倍體分析+HPV共陽(yáng)性涉及到LSIL、HSIL+癌，并隨病變嚴(yán)重程度占比增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.512，P=0.029)，與病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在活檢病理陰性病例中，DNA倍體分析+HPV共陽(yáng)性也有一定占比(6.25%)，但比較病變嚴(yán)重性及病理結(jié)果陽(yáng)性病例DNA倍體分析+HPV共陽(yáng)性占比34.38%，筆者認(rèn)為可以忽略不計(jì)，DNA倍體分析HPV共陽(yáng)性時(shí)要立即轉(zhuǎn)診陰道鏡，否則有可能漏掉子宮頸高級(jí)別病變。(2)在活檢病理陽(yáng)性病例中，DNA倍體分析或HPV陽(yáng)性占比31.25%，在活檢病理陰性病例中占比23.44%。提示該標(biāo)準(zhǔn)活檢將有不少患者病理結(jié)果正常，存在過(guò)度干預(yù)，但筆者認(rèn)為該情況同樣應(yīng)該轉(zhuǎn)診陰道鏡。理由如下：①雖然上述兩種情況存在差異，但如果不轉(zhuǎn)診陰道鏡，將有可能漏掉HSIL，HSIL中DNA倍體分析或HPV陽(yáng)性占比9.38%，預(yù)示可能漏掉9.38%的HSIL。②轉(zhuǎn)診陰道鏡可以根據(jù)陰道鏡情況決定是否取子宮頸活檢，以免漏診HSIL。(3)在活檢病理陽(yáng)性病例中，無(wú)論是LSIL、HSIL+癌，均無(wú)DNA倍體分析+HPV共陰性?；顧z病理陰性病例中，發(fā)現(xiàn)3例DNA倍體分析+HPV共陰性，占比4.69%。這提示DNA倍體分析HPV共陰性時(shí)，可以不用干預(yù)，至少可減少4.69%的陰道鏡檢查，定期LBP復(fù)查即可，符合NCCN子宮頸癌篩查指南制定ASC-US的處理方式[10]，將來(lái)有大樣本數(shù)據(jù)支持更好。

總之，DNA倍體分析聯(lián)合HPV檢測(cè)對(duì)子宮頸LBP篩查報(bào)告中的ASC-US病例具有輔助診斷價(jià)值，值得臨床推廣應(yīng)用。