王彬，齊縣偉，張憲亮

動脈粥樣硬化是臨床常見疾病之一，其發(fā)生發(fā)展與內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)，內(nèi)皮細胞功能紊亂是心血管疾病的早期病理特征之一，研究表明內(nèi)皮細胞損傷可引起動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展[1]。氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）可以促使內(nèi)皮細胞損傷進而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生，如何減輕內(nèi)皮細胞損傷成為預防及治療心血管疾病的重點研究[2,3]。微小RNA（miRNA）可調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程，研究表明miRNA可參與oxLDL誘導的主動脈內(nèi)皮細胞損傷過程[4]，積極探尋新型miRNA分子有助于揭示血管內(nèi)皮細胞損傷的分子機制。微小RNA-193a-3p（miR-193a-3p）在骨關(guān)節(jié)炎中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制炎癥因子的表達及細胞凋亡[5]。但miR-193a-3p在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚處未知。生物信息學分析顯示S100鈣結(jié)合蛋白A4（S100A4）可能是miR-193a-3p的靶基因，S100A4可促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并可在動脈粥硬化斑塊內(nèi)上調(diào)表達[6,7]。但miR-193a-3p是否可通過調(diào)控S100A4表達而影響oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷尚未可知。因此，本研究通過oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞，觀察miR-193a-3p與S100A4的表達變化，探討其對細胞氧化應(yīng)激及細胞凋亡的影響，為miR-193a-3p靶向調(diào)控S100A4治療動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株EVC-304（美國ATCC細胞庫）。oxLDL（上海魯汶生物科技有限公司）。杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Trizol試劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄及SYBR熒光染料試劑盒（日本TaKaRa公司）；miR-193a-3p寡核苷酸模擬物（miR-193a-3p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）、S100A4小干擾RNA（si-S100A4）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-193a-3p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-193a-3p）、陰性對照序列（anti-miR-NC）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；pcDNA3.1（上?？吕咨锟萍加邢薰荆?；細胞凋亡試劑盒（美國Sigma公司）；兔抗人S100A4抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗人Bax、Bcl-2抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（北京吉美生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組EVC-304細胞加入0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞密度為1×106/ml，接種于24孔板（100 μl/孔），使用含有100 μg/ml的oxLDL的培養(yǎng)基處理細胞24 h[8]，命名為oxLDL組，將未經(jīng)任何處理的細胞作為Con組。分別將miR-NC、miR-193a-3p mimics、si-NC、si-S100A4、miR-193a-3p mimics與pcDNA、miR-193a-3p mimics與pcDNA-S100A4轉(zhuǎn)染至EVC-304細胞48 h，用含有100 μg/ml的oxLDL的培養(yǎng)基處理細胞24 h，分別命名為oxLDL+miRNC組、oxLDL+miR-193a-3p組、oxLDL+si-NC組、oxLDL+si-S100A4組、oxLDL+miR-193a-3p+pcDNA組、oxLDL+miR-193a-3p+pcDN A-S100A 4組。轉(zhuǎn)染過程參照Lipofectamine2000試劑說明書。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中miR-193a-3p、S100A4 mRNA的表達水平采用Trizol法提取細胞中總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照熒光定量PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。miR-193a-3p以U6為內(nèi)參，S100A4以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-193a-3p、S100A4 mRNA的相對表達量。

1.2.3 檢測MDA含量與SOD、GSH-Px活性收集各組細胞，加入裂解液，冰上裂解2 h，離心收集上清液，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，按照試劑盒說明書檢測GSH-Px活性。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率收集各組EVC-304細胞，預冷PBS洗滌，收集細胞沉淀，加入500 μl Binding Buffer懸浮細胞，參照細胞凋亡檢測試劑盒依次加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-193a-3p的靶基因StarBase預測顯示S100A4的3’UTR區(qū)含有miR-193a-3p的結(jié)合位點，構(gòu)建野生型載體WT-S100A4、突變型載體MUT-S100A4，分別將WT-S100A4、MUT-S100A4與miR-NC、miR-193a-3p mimics共轉(zhuǎn)染至EVC-304細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測各組熒光素酶活性。分別將miRNC、miR-193a-3p mimics、anti-miR-NC、antimiR-193a-3p轉(zhuǎn)染至EVC-304細胞，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，收集細胞，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組細胞中S100A4蛋白水平。

1.2.6 Western blot檢測S100A4、Bax、Bcl-2蛋白表達收集各組EVC-304細胞，加入適量RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4℃條件下經(jīng) 12 000 r/min離心15 min，收集上清液。檢測蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入S100A4、Bax、Bcl-2一抗稀釋液（1:1000），4℃孵育24 h，分別加入二抗稀釋液（1:2000），滴加ECL顯影，采用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-193a-3p和S100A4在oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷中的表達與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細胞中miR-193a-3p的表達水平顯著降低（P＜0.05），S100A4 mRNA及蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 S100A4蛋白表達

表1 miR-193a-3p和S100A4在oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷中的表達（n=9）

2.2 miR-193a-3p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激的影響與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細胞中MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05）；與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-193a-3p組血管內(nèi)皮細胞中MDA含量顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）（表2）。

表2 miR-193a-3p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激的影響（n=9）

2.3 miR-193a-3p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-193a-3p組血管內(nèi)皮細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖2，表3）。

表3 miR-193a-3p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響（n=9）

圖2 miR-193a-3p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響（A：凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

2.4 抑制S100A4表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響與oxLDL+si-NC組比較，oxLDL+si-S100A4組血管內(nèi)皮細胞中MDA含量顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05），細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖3，表4）。

表4 抑制S100A4表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響（n=9）

圖3 抑制S100A4表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響（A：S100A4和凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

2.5 miR-193a-3p靶向調(diào)控S100A4的表達StarBase預測顯示miR-193a-3p與S100A4存在結(jié)合位點（圖4A）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型載體WT-S100A4的細胞實驗中，miR-193a-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-S100A4的細胞實驗中，miR-193a-3p組熒光素酶活性與miRNC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表5）。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-193a-3p組細胞中S100A4蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組比較，antimiR-193a-3p組細胞中S100A4蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖4B，表6）。

表5 雙熒光素酶報告實驗（n=9）

表6 miR-193a-3p調(diào)控S100A4的表達（n=9）

圖4 miR-193a-3p靶向調(diào)控S100A4的表達（A: S100A4的3’UTR中含有與miR-193a-3p互補的核苷酸序列；B:S100A4蛋白表達）

2.6 S100A4過表達逆轉(zhuǎn)了miR-193a-3p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的作用與oxLDL+miR-193a-3p+pcDNA組比較，oxLDL+miR-193a-3p+pcDNA-S100A4組血管內(nèi)皮細胞中MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖5，表7）。

3 討論

oxLDL可引起內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展，調(diào)控miRNA表達可減輕內(nèi)皮細胞損傷及抑制炎癥因子的釋放[9,10]。但仍有部分miRNA在血管內(nèi)皮細胞損傷過程中的分子機制尚未闡明，因而本研究積極探索新型miRNA分子并分析其對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響及其分子機制。

miR-193a-3p表達水平升高可抑制腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11]。研究表明miR-193a-3p表達量降低可促進脂多糖誘導的細胞凋亡及炎性損傷[12]。相關(guān)報道指出miR-193a-3p在阿爾茨海默病患者和阿爾茨海默病細胞模型中表達下調(diào)，過表達miR-193a-3p可降低Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡[13]。與上述研究報道相似，本研究結(jié)果顯示miR-193a-3p在oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞中表達下調(diào)，提示miR-193a-3p表達量降低可能促進oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷。本研究結(jié)果顯示oxLDL處理后血管內(nèi)皮細胞中MDA含量升高，而SOD、GSH-Px活性降低，進一步分析顯示miR-193a-3p過表達后明顯降低MDA含量，增強SOD、GSH-Px活性。研究表明氧化應(yīng)激是造成動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細胞損傷的重要分子機制，oxLDL可促使血管內(nèi)皮細胞中SOD、GSHPx活性降低，增加MDA含量，細胞中MDA含量與SOD、GSH-Px活性可間接反映細胞氧化損傷程度[14,15]。本研究結(jié)果提示miR-193a-3p過表達具有抗oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的作用。研究表明氧化應(yīng)激水平升高還可能促進細胞凋亡，Bcl-2屬于抑制細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，其表達增強可抑制細胞凋亡，Bax是促凋亡蛋白，其表達增強可誘導細胞凋亡，Bax與Bcl-2可通過調(diào)控線粒體膜通透性調(diào)節(jié)細胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示oxLDL處理后血管內(nèi)皮細胞凋亡率顯著升高，而miR-193a-3p過表達能夠明顯降低血管內(nèi)皮細胞凋亡率，還可抑制Bax表達，促進Bcl-2表達，提示miR-193a-3p過表達可降低血管內(nèi)皮細胞凋亡率而保護血管內(nèi)皮細胞。

S100A4表達量升高可促進脂多糖誘導的小鼠子宮內(nèi)膜炎的發(fā)展[17]。研究表明S100A4表達量升高可促進骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生及發(fā)展[18]。相關(guān)報道指出S100A4在不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中表達上調(diào)，其表達量升高可增加心血管疾病發(fā)生的風險[19]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞中S100A4的表達量明顯增高，進一步分析顯示抑制S100A4表達可明顯減弱oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化損傷，并可降低MDA含量及增強SOD、GSH-Px活性，還可抑制oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡，其主要機制可能是通過調(diào)控Bax、Bcl-2蛋白表達而發(fā)揮作用。提示抑制S100A4表達可明顯抑制oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化損傷及細胞凋亡。研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot實驗證實miR-193a-3p能夠靶向結(jié)合S100A4，還可負向調(diào)控S100A4的表達，進一步研究顯示S100A4過表達可明顯減弱miR-193a-3p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的作用，提示miR-193a-3p過表達可能通過靶向調(diào)控S100A4的表達從而增強oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞抗氧化能力，并可抑制細胞凋亡，從而對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用。

綜上所述，miR-193a-3p可靶向調(diào)控S100A4表達從而減輕oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化損傷及抑制細胞凋亡，可為揭示血管內(nèi)皮細胞損傷修復的分子機制提供理論依據(jù)，還可為臨床上動脈粥樣硬化的靶向治療提供科學依據(jù)。