劉宏,駱珅,江正強,楊紹青,劉軍,閆巧娟*

1(中國農業(yè)大學 工學院,北京,100083)2(中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京,100083)

瓜爾豆是一年生耐旱的豆科植物，主要用來生產瓜爾膠，廣泛應用于食品、石油等工業(yè)中[1]。瓜爾豆粕是瓜爾膠生產過程中的副產物，含有33%～45%的蛋白質，且比大豆粕價格便宜，是一種開發(fā)潛力很大的植物蛋白資源，但由于抗營養(yǎng)因子的存在限制了其在食品等工業(yè)上的應用[2]。豆粕經微生物發(fā)酵后，不僅可以去除部分抗營養(yǎng)因子，而且會產生小分子肽類、酚類、黃酮類活性成分，大大地提高其營養(yǎng)價值、活性成分和抗氧化等功能并改善其品質[3-7]。盡管利用農副產品作為發(fā)酵基質進行固體發(fā)酵的研究很多，所用原料大多為大豆粕等大豆加工的副產品，其他農副產品如瓜爾豆粕等的研究相對較少，未能充分發(fā)掘其價值。貝萊斯芽孢桿菌作為潛在的發(fā)酵食品發(fā)酵劑，能增加發(fā)酵食品的營養(yǎng)成分和功能活性[8]。CAO等[9]利用貝萊斯芽孢桿菌SN-1發(fā)酵產胞外多糖，可作為天然的抗氧化劑和益生菌應用于食品工業(yè)。LIU等[10]利用貝萊斯芽孢桿菌DP-2發(fā)酵豆粕，抗營養(yǎng)因子大豆抗原蛋白和β-伴大豆球蛋白分別降低了78%和43%，粗蛋白和可溶性蛋白分別增加了13.45%和12.53%。目前尚未見貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵瓜爾豆粕的研究報道。

血栓性疾病嚴重危害人類健康，發(fā)病率和死亡率居各種疾病之首。據(jù)統(tǒng)計，目前全世界每年約有1 700萬患者死于血栓性疾病，且仍呈高發(fā)態(tài)勢[11]。因此，高效溶栓藥物的研制備受關注。目前臨床上常用的尿激酶、鏈激酶和纖溶酶原激活劑等溶栓藥物存在副作用大、價格昂貴、半衰期短等缺點。相比之下，微生物源纖溶酶，具有可口服、安全、高效、持久和廉價等優(yōu)勢而備受青睞[12]。

本研究利用從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中篩選的1株高產纖溶酶的貝萊斯芽孢桿菌CAU263對農業(yè)副產物進行固體發(fā)酵，研究其活性成分、溶栓及抗氧化活性，為瓜爾豆粕的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓜爾豆粕,北京瓜爾潤科技股份有限公司；凝血酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛纖維蛋白原、DPPH、Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)、水溶性維生素E，美國Sigma-Aldrich公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉,英國Oxoid公司；其他試劑如無說明均為國產分析純,北京化工廠。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)CAU263為本實驗室自行篩選,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心,保藏號為CGMCC 20318。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱,太倉市豪城實驗儀器制造有限公司；TYAIB立式壓力蒸汽滅菌鍋,寧波久興醫(yī)療器械有限公司；LHS-500L恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司；GL-20B高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠；LGJ-10真空冷凍干燥機,北京松源華興科技發(fā)展有限公司；TU—1800PC紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器設備有限責任公司；DK-S24恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設備有限公司；Thermo Multiskan FC酶標儀,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5、蛋白胨10、NaCl 10,121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5、蛋白胨10、NaCl 10、瓊脂20,121 ℃滅菌20 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：60 g磨碎過20目篩的農業(yè)副產物裝入1 L三角瓶中,加入60 mL蒸餾水浸潤12 h,121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 種子液的制備

挑取保存于LB固體培養(yǎng)基上的貝萊斯芽孢桿菌CAU263單菌落接入裝液量為10 mL的50 mL三角瓶中,37 ℃搖床培養(yǎng)10 h獲得種子液。

1.3.3 固體發(fā)酵方法

將種子液稀釋1 000倍后按農業(yè)副產物質量的5%混勻于120 mL無菌水[m(農業(yè)副產物)∶V(水)=1∶2]中,再接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,在37 ℃、70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。將發(fā)酵結束的樣品真空冷凍干燥48 h后,磨碎過20目篩,獲得凍干粉樣品。

對照樣品(未發(fā)酵)：用3 mL無菌水代替種子液,其余步驟同上。

原料樣品：原料不經任何處理。

1.3.4 單因素發(fā)酵條件優(yōu)化

以纖溶活性為評價指標,逐級優(yōu)化,考察固體發(fā)酵基質農業(yè)副產物種類(瓜爾豆粕、豆餅粉、菜籽粕、黃豆粕、棉籽粕、花生粉餅、稻米粕、油茶籽粕、小麥麩皮、燕麥麩皮、玉米芯和豆殼)、蒸煮時間(25、30、35、40、45 min)、加水量[m(固體基質)∶V(水)=1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、接種量(3%、4%、5%、6%、7%,質量分數(shù))、發(fā)酵時間(12、24、36、48、60 h)5個因素對纖溶酶產量的影響。

1.3.5 樣品提取液的制備

分別取10 g發(fā)酵、對照及原料凍干粉樣品,加入100 mL水于25 ℃、200 r/min下提取2 h,10 000 r/min離心10 min后,收集上清液待測,水提液樣品質量濃度為100 mg/mL。

1.3.6 纖溶活性的測定

纖溶活性測定按照HUY等[13]的纖維蛋白降解法并稍作修改。將0.4 mL 0.72%纖維蛋白原溶液及1.4 mL 50 mmol/L硼砂緩沖液加入離心管中混勻后,放入37 ℃水浴鍋中預熱5 min。加入0.1 mL 20 U/mL凝血酶,混勻后在37 ℃水浴鍋中反應10 min。將樣品水提液稀釋至合適濃度后,加入0.1 mL樣品水提液稀釋液于上述試液中,混勻后在37 ℃下反應60 min,每隔20 min振蕩1次。反應結束時立刻加入500 μL 0.2 mol/L的三氯乙酸溶液終止反應,然后于10 000 r/min下離心10 min,取上清液在275 nm處測定吸光值。對照處理：先加入500 μL三氯乙酸溶液,后加入0.1 mL樣品水提液,其余步驟同上。纖溶活性的定義：在275 nm下,與樣品對照相比,樣品的吸光值1 min增加0.01所需的酶量相當于1個酶活力單位(FU)。按公式(1)計算：

(1)

式中,X：樣品測定液的纖溶活性,FU/mL,根據(jù)樣品水提液中折合瓜爾豆粕的質量,將結果換算為FU/g DW；Ar：樣品測定液的吸光值；Ac：對照的吸光值；60：反應時間為60 min,以1 min計；0.1：反應的樣品體積是0.1 mL；N：稀釋倍數(shù)。

1.3.7 抗凝血活性的測定

按照WEI等[14]和劉夢潔等[15]的測定方法并稍作修改。將纖維蛋白原和凝血酶溶于pH 7.2，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.12 mmol/L NaCl),配制成質量分數(shù)為0.1%的纖維蛋白原溶液及4 U/mL的凝血酶溶液。分別吸取140 μL 0.1%纖維蛋白原、樣品水提液稀釋液加入96孔板中,放置酶標儀中于405 nm處測定吸光值,5 min后加入30 μL 4 U/mL凝血酶,于37 ℃反應10 min后于405 nm處測定吸光值。陽性對照為用40 μL 10 mg/mL的肝素鈉代替樣品,空白對照為用40 μL Tris-HCl緩沖液代替樣品,其余操作同上。樣品的抗凝血活性按公式(2)計算,并根據(jù)樣品質量濃度與抗凝血活性的關系計算出樣品抗凝血活性IC50值(表示抗凝血活性抑制率為50%時所需的樣品質量濃度)。計算公式如下：

(2)

式中,X：某質量濃度下樣品測定液的抗凝血活性百分比；A1：反應10 min后空白對照的吸光度；A2：預熱5 min后空白對照的吸光度；A3：反應10 min后樣品測定的吸光度；A4：預熱5 min后樣品待測液的吸光度。

1.3.8 總酚含量的測定

采用福林酚法[16]。將樣品水提液稀釋10倍后用作待測液(10 mg/mL)。以沒食子酸作為標準品制作標準曲線,單位為mg GAE/mL,根據(jù)瓜爾豆粕凍干粉質量,將結果換算為mg GAE/g DW(全文均以干重計)。

1.3.9 總異黃酮含量的測定

參照LI等[17]的方法并稍作修改。將樣品水提液稀釋10倍后用作待測液(10 mg/mL),將100 μL樣品待測液和6 μL質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液加入96孔板中混合均勻后反應6 min,再加入6 μL質量分數(shù)為10%的Al(NO3)3溶液反應6 min,然后加入80 μL質量分數(shù)為4%的NaOH溶液終止反應,加入8 μL體積分數(shù)為50%的乙醇將反應體系補足至200 μL,靜置15 min后在510 nm下測定吸光值。以蘆丁為標準品制作標準曲線,單位為mg RE/mL,根據(jù)瓜爾豆粕凍干粉質量,將結果換算為mg RE/g DW(全文均以干重計)。

1.3.10 多肽含量的測定

采用鄰苯二甲醛法[18]。用Gly-Leu二肽作為標準品制作標準曲線,單位為mg/mL,然后根據(jù)瓜爾豆粕凍干粉質量,將結果換算為mg/g DW(全文均以干重計)。

1.3.11 還原糖含量的測定

采用二硝基水楊酸法[19]。以葡萄糖制作標準曲線,還原糖含量根據(jù)瓜爾豆粕凍干粉質量,結果以mg/g DW表示(全文均以干重計)。

1.3.12 DPPH自由基清除能力的測定

將DPPH自由基溶解于無水乙醇中,配制成0.1 mmol/L DPPH溶液。將40 μL的樣品測定液與200 μL的DPPH溶液在96孔板中混合均勻,在暗處避光反應30 min后于517 nm處測定吸光值A1。同時測定40 μL無水乙醇溶液與200 μL DPPH溶液混合后的吸光度A2(陰性對照),及40 μL樣品溶液與200 μL無水乙醇溶液混合后的吸光度A3(陽性對照)[20-21]。按公式(3)計算DPPH自由基清除率：

(3)

以抗氧化劑維生素E(Trolox, TE)為陽性對照，將樣品換算成TE當量來表示抗氧化能力，單位為μmol TE/g DW。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵產纖溶酶

2.1.1 農業(yè)副產物種類對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵產纖溶酶的影響

如表1所示,瓜爾豆粕作為固體發(fā)酵基質時,產纖溶酶的水平最高,纖溶活性達到117.7 FU/g DW,其次是黃豆粕和豆餅粉,纖溶活性分別達到111.3和110.1 FU/g DW。而以小麥麩皮作為固體發(fā)酵基質時,無纖溶活性。因此,選擇瓜爾豆粕作為最適固體發(fā)酵基質。

表1 不同種類農業(yè)副產物對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵產纖溶酶的影響

近年來,人們對固體發(fā)酵產酶的興趣日益增加,最重要的原因之一是工農業(yè)副產物作為微生物生長基質的低成本和適宜性[22]。目前,豆粉、稻米粕、玉米麩皮、葵花籽粕、麥麩等都可以作為有機氮源或碳源來進行固體發(fā)酵產酶和提升營養(yǎng)價值[23]。當固體基質為麥麩時比米糠和綠豆皮產纖溶活性更高[24]。PAN等[25]以黃豆粕作為主要發(fā)酵基質,最終獲得纖溶酶產量達3 787 U/mL。BI等[26]同樣以黃豆粕作為發(fā)酵基質,經過發(fā)酵條件優(yōu)化纖溶酶產量達到1 347.4 IU/g。瓜爾豆粕能促使貝萊斯芽孢桿菌CAU263分泌大量纖溶酶,可能是由于瓜爾豆粕含有高達50%的蛋白質,還有皂苷、酚類化合物、異黃酮和必需氨基酸組成,含有豐富全面的營養(yǎng)物質[27],可有效促進貝萊斯芽孢桿菌CAU263的生長及代謝。因此選擇瓜爾豆粕作為貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵產纖溶酶的最適發(fā)酵基質。

2.1.2 蒸煮時間對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

不同蒸煮時間對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響如圖1所示。蒸煮時間為40 min時,纖溶活性最高，為192.9 FU/g,因此40 min為最適蒸煮時間。

圖1 不同蒸煮時間對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

在瓜爾豆粕發(fā)酵過程中,不同瓜爾豆粕原料蒸煮時間使得其質構的變化程度不同,從而使蛋白質的變性程度不同。蒸煮不足或過度,發(fā)酵過程中會因為蛋白質未變性或過度變性而影響微生物的生長及纖溶酶的產生。而適宜的蒸煮時間會使蛋白質適當變性從而能被微生物更充分的利用,達到促進微生物生長及產酶的目的[28]。

2.1.3 加水量對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

加水量對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響如圖2所示。

圖2 不同加水量對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

當m(瓜爾豆粕)∶V(水)=1∶2時,纖溶活性最高,達208.8 FU/g。適當?shù)募铀繒黾庸腆w發(fā)酵基質中營養(yǎng)物質的溶解性,促進微生物的生長[28]。當水分過多時,將會減少固體發(fā)酵基質的孔隙率,降低氧的傳遞和散熱[29]。而水分過低時,固體發(fā)酵基質膨脹度低,菌體生長代謝受到抑制,導致纖溶酶產量降低[30]。因此選擇m(瓜爾豆粕)∶V(水)=1∶2作為最適加水量。

2.1.4 接種量對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

由圖3可知,接種量為5%時發(fā)酵瓜爾豆粕的纖溶活性最高,為230.2 FU/g。當接種量過少時,菌體生長慢且利用固體發(fā)酵基質不足,從而所產的酶量較少；接種量過多時,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質不能滿足菌體生長需要且容易形成白色菌膜等粘稠物質,不利于微生物的生長代謝,致使產酶量下降[31]。因此選擇5%為最適接種量。

圖3 不同接種量對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

2.1.5 發(fā)酵時間對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

發(fā)酵時間對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響結果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵時間對貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕產纖溶酶的影響

發(fā)酵瓜爾豆粕的纖溶活性在發(fā)酵12～48 h時持續(xù)增加,發(fā)酵48 h時達到最高,為231.6 FU/g。之后隨著發(fā)酵時間的增加,發(fā)酵瓜爾豆粕的纖溶活性逐漸下降。

在發(fā)酵前期,隨著發(fā)酵時間的延長,貝萊斯芽孢桿菌CAU263與瓜爾豆粕表面接觸的時間延長,其吸收利用原料中營養(yǎng)物質產酶的時間就越長,發(fā)酵效果就越好。而發(fā)酵后期,隨著發(fā)酵時間延長,過量的細菌使培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質不能足量供應,甚至因缺氧等原因而受損或死亡。對纖溶酶的產生造成不利影響[32]。

2.2 貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕活性成分評價

對最適產酶發(fā)酵條件下制備的發(fā)酵瓜爾豆粕活性成分(總酚、總異黃酮、還原糖和多肽)分析結果如表2所示。瓜爾豆粕原料及對照的總酚含量分別為2.4和1.9 mg GAE/g,發(fā)酵后總酚含量增加到9.4 mg GAE/g,比原料及對照分別提高了2.9和3.9倍。瓜爾豆粕原料的總異黃酮含量為11.5 mg RE/g,對照及發(fā)酵瓜爾豆粕的總黃酮含量分別為8.2和5.6 mg RE/g,比原料分別下降了28.7%和51.3%。原料、對照和發(fā)酵瓜爾豆粕的還原糖含量相近,分別為133.7、124.8和126.8 mg/g。瓜爾豆粕原料及對照的多肽含量相近,分別為22.1和22.6 mg/g,發(fā)酵瓜爾豆粕的多肽含量為189.5 mg/g,比原料及對照分別提高了7.6和7.4倍。

表2 貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕活性成分變化

XU等[33]評估了不同發(fā)酵豆制品中的活性成分。結果表明,酚類物質含量顯著增加,總異黃酮類物質含量下降。在發(fā)酵過程中,微生物所產的蛋白酶會適度水解原料中的大分子蛋白質,從而產生較多的肽類物質,可能含有Tyr和Trp等具有較強抗氧化活性的氨基酸,再者發(fā)酵后產生了更多的酚類物質,這些抗氧化肽和酚類化合物可以提高發(fā)酵樣品的抗氧化能力,幫助保護身體免受自由基的攻擊,進一步降低許多慢性疾病的風險,如癌癥和心血管疾病[34]。

2.3 貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕的功能活性

對最適產酶發(fā)酵條件下制備的發(fā)酵瓜爾豆粕功能活性(纖溶活性、抗凝血活性和DPPH自由基清除能力)分析結果如表3所示。從表3可知,瓜爾豆粕原料及對照無纖溶活性和抗凝血活性,發(fā)酵瓜爾豆粕的纖溶活性為231.3 FU/g,抗凝血活性IC50為0.28 mg/mL。瓜爾豆粕原料的DPPH自由基清除能力為22.1 μmol TE/g,對照樣品的DPPH自由基清除能力為13.1 μmol TE/g,與原料相比下降了41%,可能是受高溫高壓滅菌處理的影響,損失了部分抗氧化活性物質。發(fā)酵后瓜爾豆粕的DPPH自由基清除能力為33.0 μmol TE/g,與原料及對照相比,分別提高了49.1%和152.7%。

表3 貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕的功能活性

目前,國內外學者在提高發(fā)酵豆制品的溶栓能力方面做出了很多努力,主要包括高產纖溶酶菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化。劉夢潔等[15]用枯草芽孢桿菌MJ-1制備了具有較高納豆激酶活性的黃豆納豆(90.2 FU/g),其提取物質量濃度在3 mg/mL時的抗凝血活性可達91%。LEE等[35]通過篩選菌株得到1株高產纖溶酶的枯草芽孢桿菌,優(yōu)化發(fā)酵條件后使木豆納豆的纖溶活性達到53.0 FU/g,經動物實驗發(fā)現(xiàn),木豆納豆的水提物顯著改善了自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓,具有改善心血管疾病的潛力。FENG等[32]同樣采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵木豆,纖溶活性達53.0 FU/g。吳珊等[36]利用高產纖溶酶的解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118制備發(fā)酵豆腐,其纖溶活性達86.1 FU/g,抗凝血活性IC50為0.17 mg/mL。WEI等[14]采用解淀粉芽孢桿菌LSSE-62發(fā)酵鷹嘴豆,在最優(yōu)發(fā)酵條件下纖溶活性達39.2 FU/g,且發(fā)酵鷹嘴豆的抗凝血活性和抗氧化活性較未發(fā)酵均有提升。目前已報道的產纖溶酶的發(fā)酵豆制品主要采用枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌作為發(fā)酵劑,纖溶活性大多在20～80 FU/g,溶栓能力高低差異較大,本研究采用貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵瓜爾豆粕,不僅菌種新穎,且在纖溶活性上領先于目前報道的同類產品。另外,發(fā)酵瓜爾豆粕的抗氧化能力可能來自于含量較高的總酚和多肽類物質,XU等[33]測定了27種豆豉、豆醬、納豆等發(fā)酵豆制品的抗氧化活性發(fā)現(xiàn),不同類型的發(fā)酵豆制品的DPPH自由基清除能力不同,其中黃豆醬類的DPPH自由基清除能力在1.9～20.6 μmol TE/g之間,豆豉類在2.7～23.1 μmol TE/g,納豆類在2.6～4.5 μmol TE/g。本研究的發(fā)酵瓜爾豆粕具有較高的DPPH自由基清除能力。

3 結論

本文利用高產纖溶酶的菌株貝萊斯芽孢桿菌CAU263進行固體發(fā)酵,采用單因素試驗優(yōu)化得到了產纖溶酶的最適發(fā)酵條件,即固體發(fā)酵基質為瓜爾豆粕、蒸煮時間40 min、加水量[m(瓜爾豆粕)∶V(水)]=1∶2、接種量5%、發(fā)酵時間48 h。在最適發(fā)酵條件下對其活性成分、溶栓及抗氧化活性進行分析。其中,發(fā)酵瓜爾豆粕的總酚及多肽含量比瓜爾豆粕原料和未發(fā)酵瓜爾豆粕顯著提高,同時,顯著提高了纖溶活性、抗凝血活性及抗氧化活性。結果表明,貝萊斯芽孢桿菌CAU263固體發(fā)酵瓜爾豆粕顯著提高瓜爾豆粕的營養(yǎng)價值和功能活性。