張 猛，賈 星，張和平，馬學波，包秋華

干酪乳桿菌Zhang （Lactobacillus casei Zhang，Lb.casei Zhang）是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中分離篩選的一株具有益生特性的乳酸菌[1]。經(jīng)研究表明該菌株具有良好的耐酸性、人工腸胃液耐受性及膽鹽耐受性，是我國第一個完成的乳酸菌基因全序列測定的菌株[1-3]。干酪乳桿菌Zhang 是我國目前研究較全面的一株益生菌，是能通過改善腸道微生物平衡而對宿主產(chǎn)生有益影響的乳酸菌[1，4]。

乳酸菌對營養(yǎng)、環(huán)境條件要求高，對外界的抵抗力差，難以制備和長期保存。乳酸菌在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中，不可避免的要經(jīng)歷低溫、低pH 值、寡營養(yǎng)、外界環(huán)境變化、光照及輻射強度等不利條件，一旦外界營養(yǎng)條件或環(huán)境壓力發(fā)生改變，菌株的形態(tài)特征、生理狀況和功能特性等都會發(fā)生改變，這不僅導致菌株活力下降，也影響了菌株在工業(yè)化生產(chǎn)中的發(fā)酵性能、代謝產(chǎn)物的合成及其益生特性，有些乳酸菌能夠進入活的非可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）態(tài)[5-9]。目前乳酸菌面臨的多種脅迫中，酸脅迫是最常見的一種環(huán)境脅迫[7]。環(huán)境中pH 值的下降會抑制乳酸菌自身的生長繁殖。除酸脅迫外，低溫脅迫也會對細胞造成一系列傷害，包括細胞脫水、細胞膜破裂以及內(nèi)容物泄露等，導致細胞不可逆的損傷或者死亡[4，6]。

關(guān)于干酪乳桿菌Zhang 和乳酸菌的抗逆基因和蛋白表達的報道有很多。烏日娜等[10]通過雙向凝膠電泳技術(shù)研究了其在不同生長階段下差異表達蛋白質(zhì)，結(jié)果表明酸脅迫可誘導干酪乳桿菌Zhang 產(chǎn)生復雜的反應(yīng)，差異蛋白主要歸屬于應(yīng)激蛋白及不同代謝途徑相關(guān)蛋白，參與調(diào)節(jié)糖代謝途徑、氨基酸合成、脂肪酸合成途徑等；通過調(diào)節(jié)ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的活性以及調(diào)控雙組分系統(tǒng)及離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的活性等來應(yīng)對環(huán)境的改變。其它大量研究也表明，乳酸菌遭遇逆境環(huán)境，會激活多種應(yīng)激反應(yīng)去應(yīng)對不利于生存的條件，如乳酸菌會通過改變代謝途徑，增加ATP 的產(chǎn)生[10-11]、自我調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH 值[12-13]、在細胞膜水平上的脅迫響應(yīng)[14-15]以及大分子的保護與修復等應(yīng)激反應(yīng)來抵御環(huán)境脅迫從而提高存活率[16-17]。蛋白的變化首先表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，干酪乳桿菌Zhang 全基因組測序的完成為研究該菌的基因轉(zhuǎn)錄表達分析奠定了基礎(chǔ)[2]。本試驗將在前人基礎(chǔ)上，選擇干酪乳桿菌Zhang 能夠進入VBNC 態(tài)的一個逆境條件，研究干酪乳桿菌Zhang 在逆境脅迫初期的基因表達差異變化。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

干酪乳桿菌Zhang，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫保存。

1.2 材料與試劑

MRS 液體培養(yǎng)基，英國Oxoid 公司；Eastep Super 總RNA 提取試劑盒LS1040，美國Promega公司；GoScript Reverse Transcription Mix 試劑盒，美國Promega 公司；GoTap qPCR Master Mix試劑盒，美國Promega 公司。

1.3 儀器與設(shè)備

PCR 熱循環(huán)儀、ABI StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀，美國Applied Biosystems 公司；ND-1000 型微量紫外分光光度計，美國賽默飛科技公司。

1.4 目的基因及管家基因

根據(jù)干酪乳桿菌Zhang DNA 序列 （NCBI 官網(wǎng)GeneBank accession number：CP001084）中相應(yīng)基因的序列，使用primer 5 軟件設(shè)計12 對引物，由上海美吉生物科技有限公司合成。具體見表1。

表1 實時熒光定量PCR 的內(nèi)參基因及目的基因引物Table 1 Reference genes and target genes of real-time quantitative PCR

1.5 方法

1.5.1 干酪乳桿菌Zhang 的活化和環(huán)境脅迫 將菌種資源庫的干酪乳桿菌Zhang 接種于液體MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，按2%的接種量活化3代，得到3 代菌株，測得此時的培養(yǎng)基pH 值趨于穩(wěn)定，維持于3.8±0.02。將菌液放置于4 ℃條件下進行低溫、低pH 值逆境脅迫。

1.5.2 RNA 提取 逆境脅迫的菌株分別于0，6，24 h 及3 d 取樣，首先將供試樣品搖勻后吸取1 mL 液體（約109細胞），離心收集菌體后按Eastep Super RNA 提取試劑盒說明書進行總RNA 的提取，用微量分光光度計對RNA 的質(zhì)量進行檢測。

1.5.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 以純化的RNA 為模板，使用GoScript Reverse Transcription Mix 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系見表2。將混勻的反應(yīng)體系置于PCR 儀中，以25 ℃引物退火5 min；42 ℃延伸60 min；70 ℃滅活15 min 的條件進行。得到cDNA 樣本后置于-20 ℃保存。

表2 反轉(zhuǎn)錄體系Table 2 Reverse transcription system

1.5.4 熒光定量PCR 以各時間點cDNA 為模板，采用Promega 公司的GoTap qPCR Master Mix試劑盒，熒光定量PCR 反應(yīng)體系如表3所示。將混勻的反應(yīng)體系在熒光定量PCR 儀中進行PCR擴增。每個基因做3 個重復，由Gene line K 自帶軟件采用“最大二階導數(shù)法”得到各基因各時間點表達水平的Ct值。Ct值即反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值所需的循環(huán)數(shù)，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小[18]。

表3 熒光定量PCR 擴增體系Table 3 Real-time qPCR amplification system

熒光定量PCR 擴增條件：預(yù)變性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，循環(huán)40 次。熔解曲線測定程序：95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。

熒光定量PCR 數(shù)據(jù)處理分析采用相對定量方法，目的基因的相對表達量由下列公式得出：

△Ct（測試基因）=△Ct（目的基因，測試基因）-△Ct（內(nèi)參基因，測試基因）

△Ct（校準基因）=△Ct（目的基因，校準基因）-△Ct（內(nèi)參基因，校準基因）

△△Ct=△Ct（測試基因）-△Ct（校準基因）

平均相對含量%=2-平均△△Ct

試中：△Ct（目的基因，測試基因）——待測組目的基因Ct值；△Ct（內(nèi)參基因，測試基因）——待測組管家基因Ct值；△Ct（目的基因，校準基因）——校準組目的基因Ct值；△Ct（內(nèi)參基因，校準基因）——校準組管家基因Ct值。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR 產(chǎn)物的特異性

對內(nèi)參基因及目的基因進行熒光定量PCR擴增，隨后對各個基因進行熔解曲線分析，部分熔解曲線結(jié)果如圖1。通常情況下，溶解曲線是用熒光信號強度變化負的一次導數(shù)和溫度作圖，如果得到單峰的熔解曲線，證明反應(yīng)特異性良好，無非特異擴增和引物二聚體等干擾結(jié)果因素[19]。從圖1可看出，本試驗得到了內(nèi)參基因及目的基因的單峰熔解曲線（注：Tm，DNA 雙鏈堿基對分離50%的溫度），且每個基因溫度均一、峰型較銳利，無非特異性擴增和引物二聚體所致的雜峰，表明熒光定量PCR 擴增產(chǎn)物的特異性較好，也證明所設(shè)計的引物具有較好的特異性。

圖1 熔解曲線Fig.1 Melting curve

2.2 低溫、低pH 值逆境脅迫下目的基因的表達變化

通過RT-qPCR 方法分析菌株于低溫、低pH值脅迫下的12 個基因表達差異。結(jié)果表明干酪乳桿菌Zhang 為了抵御外界低溫、低pH 值的不良環(huán)境，激活了細胞中一系列適應(yīng)性調(diào)節(jié)，如糖代謝途徑，通過調(diào)節(jié)丙酮酸代謝產(chǎn)物去向，使之傾向于參與脂肪酸合成，同時通過激活分子伴侶蛋白合成來促進其它蛋白的正確折疊，從而幫助菌體抵御低溫、低pH 值的脅迫。

2.2.1 糖代謝相關(guān)基因的表達差異結(jié)果與分析與糖代謝相關(guān)的基因共4 個，分別為LCAZH_0682、LCAZH_0721、LCAZH_1056、LCAZH_1073，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出LCAZH_0682 （蘋果酸乳酸酶基因） 脅迫24 h 的表達量增長為對照的1.766倍，脅迫3 d 的表達量為對照的1.771 倍，均與對照有顯著性差異（P<0.05）。LCAZH_0682 參與蘋果酸-乳酸發(fā)酵途徑[10，20]，此結(jié)果表明干酪乳桿菌Zhang 在低溫、低pH 值脅迫下蘋果酸乳酸酶活性增加，蘋果酸-乳酸代謝水平提高。這與王記成[20]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌Zhang 在發(fā)酵過程中會提高乳酸脫氫酶、蘋果酸/乳酸逆轉(zhuǎn)運體活性的結(jié)果相一致。

圖2 低溫、低pH 值脅迫下糖代謝相關(guān)基因表達差異圖Fig.2 Gene expression differences in carbohydrate metabolism at low temperature and low pH condition

LCAZH_0721 （6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因）在脅迫6 h 后表達量增長為對照的1.998 倍，與對照差異極顯著（P<0.01）。脅迫24 h 后增長為1.177倍，3 d 后增長為1.306 倍，均與對照有顯著差異（P<0.05）。LCAZH_0721 參與磷酸戊糖途徑。結(jié)果表明，低溫、低pH 值脅迫下的干酪乳桿菌Zhang磷酸戊糖途徑被激活。表明逆境脅迫下的干酪乳桿菌Zhang 通過調(diào)整代謝途徑，進行酸適應(yīng)。

LCAZH_1056 基因編碼PTS system cellobiose-specific transporter subunit IIA，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)絲氨酸特異性轉(zhuǎn)運蛋白，參與map02060（Phosphotransferase system，PTS）；map00500（Starch and sucrose metabolism）2 個代謝途徑，在低溫、低pH 值脅迫下其表達呈下降趨勢，脅迫6 h 后其表達量降為對照的0.767 倍，脅迫24 h 后降為0.621倍，均與對照有顯著差異（P<0.05）。脅迫3 d 后其表達量為0.567 倍，與對照差異極顯著（P<0.01）。吳重德[21]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌在正常條件下磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)絲氨酸特異性轉(zhuǎn)運蛋白活力較高，而pH 5.0 下脅迫1 h 后，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)絲氨酸特異性轉(zhuǎn)運蛋白活力顯著下降。這就表明干酪乳桿菌在低溫、低pH 值脅迫下會降低PTS 的表達。

LCAZH_1073 基因編碼UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（EC2.7.7.9），催化α-D-葡萄糖-1-磷酸和UDP-葡萄糖之間互相轉(zhuǎn)化的酶。LCAZH_1073 基因在低溫、低pH 值脅迫下表達上調(diào)，脅迫6 h 后表達量增長為對照的1.102 倍，24 h 后增長為1.267 倍，3 d 后增長為1.600 倍，均與對照有顯著差異（P<0.05）。表明低溫、低pH 值脅迫的菌株會減少自身糖原的合成。

以上試驗表明，低溫、低pH 值逆境脅迫下干酪乳桿菌Zhang 會調(diào)節(jié)糖代謝途徑，提高蘋果酸-乳酸發(fā)酵、磷酸戊糖途徑、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)絲氨酸特異性轉(zhuǎn)運蛋白的表達量以及減少自身糖原的合成。干酪乳桿菌Zhang 是一種兼性異型發(fā)酵菌，主要通過糖酵解途徑產(chǎn)生能量。由于環(huán)境中pH 值較低，H+堆積，乳酸含量高，通過LCAZH_0682（蘋果酸乳酸酶基因）的高度表達，促使乳酸外排來有效緩解H+壓力[20]。因為在蘋果酸乳酸發(fā)酵中，蘋果酸乳酸酶經(jīng)過去羧基將蘋果酸轉(zhuǎn)化為L-乳酸和CO2，蘋果酸/乳酸逆轉(zhuǎn)運體成了乳酸的載體，這一過程促使細胞質(zhì)的堿性化并允許能量產(chǎn)生。由于菌體遭受逆境脅迫時能量需求會增加，而LCAZH_0721（6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因）是磷酸戊糖途徑的第1 個限速酶，其功能為將6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸核酮糖，并生成6 分子ATP。因此在低溫、低pH 值逆境脅迫條件下的干酪乳桿菌Zhang 通過調(diào)整此代謝途徑，增加菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，增加ATP 的生成從而維持細胞在逆境脅迫下的活性。LCAZH_1056（磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)絲氨酸特異性轉(zhuǎn)運蛋白基因） 在PTS 特異性途徑中能將葡萄糖從細胞外跨膜主動運輸進入細胞，并將葡萄糖磷酸化形成6-磷酸葡萄糖，以參與糖酵解途徑。因此，分析逆境脅迫下干酪乳桿菌Zhang 趨向于降低外源物質(zhì)的向內(nèi)運輸來降低能量消耗以及不良因素對菌體的損傷。LCAZH_1073（UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶） 是在單糖——半乳糖代謝通路（KO00052）、淀粉和蔗糖代謝通路（KO00500）等多種糖的代謝通路中催化α-D-葡糖糖-1-磷酸和UDP-葡糖糖之間互相轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。環(huán)境脅迫會影響干酪乳桿菌Zhang對外界糖類的利用效率。

2.2.2 氨基酸代謝相關(guān)基因差異表達結(jié)果與分析與氨基酸代謝相關(guān)的基因共3 個，分別為LCAZH_1735、LCAZH_1743、LCAZH_2136，結(jié)果如圖3所示。

圖3表明干酪乳桿菌Zhang 在低溫、低pH 值逆境脅迫6 h 后，LCAZH_1735 （陽離子轉(zhuǎn)運酶基因）表達量降低為對照的0.272 倍，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。脅迫24 h 后表達量降低為0.412 倍，與對照有顯著性差異（P<0.05）。脅迫3 d后，表達量降低為0.275 倍，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。表明逆境脅迫的干酪乳桿菌Zhang會降低外源物質(zhì)的向內(nèi)運輸。

圖3 低溫、低pH 值脅迫下氨基酸代謝相關(guān)基因表達差異圖Fig.3 Gene expression differences in amino acid metabolism at low temperature and low pH condition

LCAZH_1743（D-谷氨酸代謝基因）在脅迫6 h 后表達量降低為對照的0.102 倍，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。脅迫24 h 后表達量降低為0.377 倍，與對照相比差異顯著（P<0.05）。脅迫3 d后表達量降低為0.121 倍，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。表明菌株降低了D-谷氨酸的代謝表達量。分析是由于低pH 值條件下的菌體細胞內(nèi)的氨基酸供應(yīng)不足，細胞傾向于氨的生成和ATP合成，D-谷氨酸轉(zhuǎn)化為堿性的γ-氨基丁酸，以此減少酸脅迫對細胞造成的損傷[22]。

LCAZH_2136（ABC 轉(zhuǎn)運體酶基因）的表達量在脅迫過程中呈現(xiàn)降低趨勢，逆境處理6 h 后表達量降為對照的0.712 倍，與對照有顯著性差異（P<0.05）。逆境處理24 h 后表達量降為0.346 倍，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。試驗結(jié)果證實了干酪乳桿菌Zhang 在低溫、低pH 值條件下會降低ABC 轉(zhuǎn)運體ATP 酶的表達。機理可能為酸脅迫使ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的活性下降[14]，以此減小逆境脅迫對細胞的損傷。

試驗表明，低溫、低pH 值逆境脅迫下干酪乳桿菌Zhang 通過調(diào)節(jié)氨基酸的合成，降低外源物質(zhì)的向內(nèi)運輸、降低D-谷氨酸的表達以及ABC轉(zhuǎn)運體ATP 酶的表達。LCAZH_1735（陽離子轉(zhuǎn)運酶基因）參與陽離子轉(zhuǎn)運，陽離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)負責外源物質(zhì)的向內(nèi)運輸，會消耗能量。低溫、低pH 值脅迫下干酪乳桿菌Zhang 會降低外源物質(zhì)的向內(nèi)運輸以減少細胞損傷及耗能反應(yīng)相關(guān)基因的表達。氨基酸是菌株生長過程所必需的營養(yǎng)因素之一。干酪乳桿菌Zhang 中LCAZH_1743（D-谷氨酸代謝基因）控制著D-谷氨酸的代謝。低溫、低pH值逆境脅迫下的細胞內(nèi)氨基酸合成不足[14]，干酪乳桿菌Zhang 通過降低氨基酸的代謝來維持菌體基本生命所需的氨基酸量。LCAZH_2136（ABC 轉(zhuǎn)運體酶基因）參與ABC 轉(zhuǎn)運，可向細胞外轉(zhuǎn)運糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等脂溶性物質(zhì)，干酪乳桿菌Zhang會通過降低ABC 轉(zhuǎn)運來減弱細胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，從而減少逆境脅迫所帶來的損傷。

2.2.3 細胞膜及脂肪酸合成基因的變化結(jié)果與分析 與細胞膜及脂肪酸合成相關(guān)的基因共3 個，分別為 LCAZH_1603、LCAZH_2067、LCAZH_2373，結(jié)果如圖4所示。

從圖4看出LCAZH_1603 （磷脂合成蛋白基因）在低溫、低pH 值逆境脅迫時表達水平降低。脅迫6 h 后其表達量是對照的0.448 倍，24 h 后為0.526 倍，3 d 后為0.467 倍，均與0 h 的表達水平有顯著性差異（P<0.05）。表明干酪乳桿菌Zhang在低溫、低pH 值脅迫下會改變飽和脂肪酸磷脂的合成，通過調(diào)節(jié)膜的脂肪酸含量、分布使細胞膜脂肪酸從飽和向不飽和方向轉(zhuǎn)化是細胞抵御低溫、低pH 值逆境脅迫的重要機制[22]。

圖4 低溫、低pH 值脅迫下細胞膜及脂肪酸代謝相關(guān)基因表達差異圖Fig.4 Gene expression differences in cell membrane and fatty acid at low temperature and low pH condition

LCAZH_2067 （環(huán)丙烷脂肪酸合成酶基因）在逆境脅迫6 h 后表達量增加為1.325 倍，與對照有顯著性差異 （P<0.05）。結(jié)果表明，干酪乳桿菌Zhang 在低溫、低pH 值脅迫下會提高環(huán)丙烷脂肪酸的表達量。研究顯示，細胞膜環(huán)丙烷脂肪酸含量與細胞在低pH 值條件下存活率有關(guān)，由于環(huán)丙烷脂肪酸可以降低膜流動性并阻止胞外有害物質(zhì)進入胞內(nèi)，同時增加環(huán)丙烷脂肪酸的含量也是干酪乳桿菌應(yīng)對酸脅迫的一種應(yīng)答機制[23]。

LCAZH_2373（短鏈醇脫氫酶基因）在逆境脅迫時，其表達水平持續(xù)降低。6 h 后表達量降為原來的0.547 倍，與對照相比有顯著性差異（P<0.05）。24 h 后表達量降到0.494 倍，脅迫3 d 后則降至0.370 倍，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。結(jié)果表明，干酪乳桿菌Zhang 在低溫、低pH 值脅迫下會降低短鏈醇脫氫酶的表達量。這和降低短鏈脂肪酸合成、增加脂肪酸的鏈長是干酪乳桿菌的一種存活機制的結(jié)論相吻合[20]。

細胞膜不僅作為細胞抵御環(huán)境脅迫的第一道屏障，乳酸菌在面臨酸、冷脅迫時，細胞膜的脂肪酸含量、分布和組成都發(fā)生著變化，這些變化主要通過改變細胞膜的流動性來適應(yīng)細菌所在的不良環(huán)境[24]。改變細胞膜脂肪酸的成分是調(diào)節(jié)細胞膜流動性的一種方式，同時也是細胞應(yīng)對逆境脅迫的一種應(yīng)對機制。試驗表明低溫、低pH 值脅迫下干酪乳桿菌Zhang 通過增加不飽和脂肪酸合成、降低飽和脂肪酸合成來增加膜脂的不飽和度；增加膜脂碳鏈長度使其更容易橫跨膜雙分子層，進而與其它的脂類和蛋白通過疏水作用結(jié)合，使脂肪酸鏈更緊湊，使膜環(huán)境更接近于“凝膠狀”，從而增加了膜的穩(wěn)定性，維持了細胞的活性[23]。環(huán)丙烷脂肪酸同樣也會調(diào)節(jié)細胞膜的流動性，干酪乳桿菌Zhang 提高環(huán)丙烷脂肪酸的表達量也是一種存活機制。

2.2.4 應(yīng)激蛋白相關(guān)基因差異表達結(jié)果與分析與應(yīng)激蛋白相關(guān)的基因共2 個，分別為LCAZH_1495、LCAZH_2207，結(jié)果如圖5所示。

圖5 低溫、低pH 值脅迫下應(yīng)激蛋白基因表達差異圖Fig.5 Gene expression differences in stress protein at low temperature and low pH condition

由圖5得出LCAZH_1495（DNA 引發(fā)酶基因）在逆境脅迫6 h 后表達量下降為對照的0.630 倍，24 h 后降為0.726 倍，3 d 后降為0.692 倍，均與對照有顯著性差異（P<0.05）。而LCAZH_2207（分子伴侶Gro EL 基因） 脅迫24 h 后增加至1.233 倍，與對照有顯著性差異（P<0.05）。此現(xiàn)象是由于細胞內(nèi)pH 值的下降會使蛋白質(zhì)在折疊時發(fā)生錯誤，導致DNA 等生物大分子受到損傷[21-22]。為了修復損傷、提高抵抗酸脅迫的能力，細胞會表達一些應(yīng)激蛋白[25]。根據(jù)蛋白組學分析，酸脅迫下的乳酸菌會誘導細胞表達包括Gro ES，Gro EL 等在內(nèi)的33 種熱休克蛋白[10]。而且酸脅迫會導致DNA 合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯等途徑中的相關(guān)蛋白表達下調(diào)。試驗與預(yù)計結(jié)果相符，證明了干酪乳桿菌Zhang 在低溫、低pH 值脅迫時，DNA 引發(fā)和復制會降低，分子伴侶表達量會增加。

試驗表明，低溫、低pH 值逆境脅迫下干酪乳桿菌Zhang 過量表達應(yīng)激蛋白Gro EL 并減弱DNA 復制相關(guān)基因的表達。LCAZH_2207（分子伴侶Gro EL 基因） 是較早發(fā)現(xiàn)的一類應(yīng)激蛋白，具有修復或解折疊損傷蛋白質(zhì)的生物學功能。研究表明Gro EL 蛋白與菌體對低pH 值、冷激等不良環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)或抵御能力有關(guān)[26]。逆境脅迫下應(yīng)激蛋白Gro EL 的高表達可能通過參與細胞能量水平的調(diào)節(jié)，使菌株能夠在不良環(huán)境下生存，或者通過保護和修復系統(tǒng)等功能來保護細胞免受酸脅迫。這與本試驗的結(jié)果相一致，表明干酪乳桿菌Zhang 在低溫、低pH 值逆境脅迫時會通過減少DNA 復制、增加分子伴侶合成來應(yīng)對不良環(huán)境。

3 結(jié)論

本研究在轉(zhuǎn)錄水平上利用實時熒光定量PCR技術(shù)對低溫、低pH 值逆境脅迫下干酪乳桿菌Zhang 的差異表達基因進行分析，成功監(jiān)測到12個基因的差異表達變化，主要涉及糖代謝、氨基酸代謝、細胞膜及脂肪酸以及應(yīng)激蛋白合成等。在應(yīng)對低溫、低pH 值的逆境脅迫時，推測干酪乳桿菌Zhang 會發(fā)生全局性響應(yīng)，通過增加乳酸的消耗、乳酸的轉(zhuǎn)移來緩解H+的脅迫，通過增加ATP 的生成、內(nèi)源糖原的合成來維持細胞的正常生命活動；通過降低相關(guān)氨基酸的合成減少胞外有害物質(zhì)進入胞內(nèi)以及胞內(nèi)大分子流出來降低損害、應(yīng)對不良環(huán)境；通過增加不飽和脂肪酸磷脂的合成以及脂肪酸的鏈長來維持細胞膜的流動性，通過增加環(huán)丙氨脂肪酸的合成來適應(yīng)低pH 值環(huán)境；通過增加應(yīng)激蛋白Gro EL 來修復不良環(huán)境下DNA 的損傷，通過降低DNA 的復制減少細胞分裂等來降低能量消耗進而維持細胞基本生命活動以應(yīng)對低溫、低pH 值的逆境脅迫。