陳忠軍，張鈺皎，胡煒東，孫子羽，蘇 杰，滿都拉*

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）和大腸桿菌（Escherichia coli）是主要的食源性病原菌，它們極易在食品加工過程中形成混合菌生物被膜?；旌暇锉荒な亲匀唤缍喾N微生物為適應(yīng)脅迫環(huán)境，通過分泌胞外多糖等基質(zhì)而形成的有利于生存的微生物集落?；旌暇锉荒じy以被清除，從而導(dǎo)致食品腐敗等食品安全性問題[1-3]。金黃色葡萄球菌是一種常見的人、畜共患病病原菌，不僅會造成細菌性食物中毒，還會對食品加工人員造成危害[4]。金黃色葡萄球菌的致病性主要與其分泌的多種毒素因子有關(guān)，包括腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）、黏附素（Adhesion factors）、溶血素（hemolysin，HL）、殺白細胞素（Panton-Valentine leucocidin，PVL）、脫皮毒素（Exfoliatives，ETs）、中毒性休克綜合征毒素（toxic shock syndrome toxin，TSST）和凝固酶（Coagulase，CaL）等[5-8]。

本文對食源性混合病原菌生物被膜（金黃色葡萄球菌-大腸桿菌-沙門氏菌）進行定性和定量檢測，以其中優(yōu)勢菌（金黃色葡萄球菌）為研究對象，通過對其特有的28 種目的毒素基因的定量，計算單一菌和混合菌生物被膜中金黃色葡萄球菌特有毒素基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，旨在進一步分析生物被膜中金黃色葡萄球菌的致病性，并為其有效防治提供依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）ATCC 14028，中國普通微生物菌種保藏管理中心；結(jié)晶紫、氯化鈉、0.1mol/L PBS、草酸銨、甲醇、冰醋酸，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Trizol試劑，天根生化科技（北京）有限公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），ROX plus、DL2000 DNA Marker，TaKaRa（寶生物）；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptone Soy Broth，TSB），北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TM4000 plus 掃描電鏡，日本株式會社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所；Synergy H1 全功能微孔板檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；NANODROP 2000 分光光度計，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；ABI7500 熒光定量PCR 儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LDZX 全自動高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；GHP 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QL-902 渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Centrifuge 5415D 離心機，艾本德中國有限公司。

2 方法

2.1 食源性混合病原菌生物被膜的制備

將大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌活化后稀釋至OD600nm=0.1（約為1.5×108CFU/mL）。經(jīng)無水乙醇浸泡過夜的不銹鋼片（0.5 cm×0.5 cm）放入TSB 試管中后滅菌，將3 種稀釋液1∶1∶1 混合后以1%的接種量接種于上述TSB 試管，37 ℃下培養(yǎng)后取出不銹鋼片，無菌PBS 輕輕漂洗3 次，去除浮游菌[9-10]。

2.2 食源性混合病原菌生物被膜的定性檢測

2.2.1 銀染法（AgNO3）對混合菌生物被膜形成能力的檢測 按照2.1 節(jié)方法，分別培養(yǎng)0.5，1，3，5，7 d 后，將清洗后的透明玻璃片在2.5%戊二醛PBS 溶液中固定1 h；蒸餾水漂洗后用飽和氯化鈣溶液結(jié)合15 min；蒸餾水浸泡清洗15 min；加入5%硝酸銀溶液反應(yīng)15 min；1%對苯二酚溶液浸泡2 min；蒸餾水漂洗后用5%硫代硫酸鈉溶液固定2 min；蒸餾水漂洗干凈后用普通光學(xué)顯微鏡觀察[11]。

2.2.2 掃描電鏡（SEM）對混合菌生物被膜形成能力的檢測 按照2.1 節(jié)方法培養(yǎng)混合菌生物被膜，取出不同培養(yǎng)階段（0.5，1，3，5，7 d）的不銹鋼片，無菌PBS 漂洗3 次后放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛中固定4 h；使用梯度乙醇脫水（50%，60%，70%，80%，90%乙醇中各浸泡10 min，100%無水乙醇浸泡2 次，15 min/次）；醋酸異戊酯置換2 次，15 min/次；樣品臨界點干燥并噴金后使用掃描電鏡進行觀察[12]。

2.3 食源性病原菌生物被膜的定量檢測

2.3.1 結(jié)晶紫染色法對混合菌生物被膜量的檢測將大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌稀釋液1∶1∶1 混合，以1%的接種量接種于裝有200 μL TSB 培養(yǎng)基的96 孔板中，37 ℃分別培養(yǎng)0.5，1，3，5，7 d。將培養(yǎng)液棄去后用300 μL 的無菌PBS沖洗3 次，60 ℃下干燥1 h，然后于每孔中添加200 μL 無水甲醇固定15 min，干燥后添加200 μL的2%結(jié)晶紫染液染色20 min，蒸餾水沖洗孔壁至沖洗液無色，干燥后于每孔中添加300 μL 的33%冰醋酸靜置10 min，微孔板檢測儀振蕩10 min 后于630 nm 下測定吸光度值，不接菌TSB 作空白對照[13]。

相對OD 值（SI）可反映出生物被膜的形成量。SI=OD/ODC（ODC等于空白孔的平均值加上其3 倍標(biāo)準(zhǔn)差而得到的OD 值）可衡量生物被膜的形成能力：04 為大量生物被膜形成量（+++）[14]。

2.3.2 病原菌生物被膜的活菌數(shù)檢測

2.3.2.1 單菌生物被膜的活菌數(shù)檢測 將3 種病原菌的稀釋液分別以1%的接種量接種于裝有不銹鋼片的TSB 試管中，37 ℃下分別培養(yǎng)6，12，24，36，48，72 h 后取出不銹鋼片，無菌PBS 輕輕漂洗3 次以去除浮游菌。無菌棉棒刮擦其表面，然后將棉棒和不銹鋼片一起放入盛有4 mL 無菌PBS 試管中，超聲水浴10 min 并漩渦振蕩后取菌懸液。然后于無菌PBS 液中做系列10 倍稀釋，選擇1 mL 適宜稀釋度液加入無菌培養(yǎng)皿中，并傾注冷卻至45 ℃的TSA 培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)48 h 后菌落計數(shù)，繪制生長曲線。

2.3.2.2 混合菌生物被膜的特定活菌數(shù)檢測 將3 種稀釋液1∶1∶1 混合后以1%的接種量接種于裝有不銹鋼片的TSB 試管中，按照2.3.1 節(jié)方法制備稀釋液，選擇1 mL 適宜稀釋度液加入無菌培養(yǎng)皿中，并傾注冷卻至45 ℃的Hektoen Enteric 瓊脂培養(yǎng)基、Baird-Parker 瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)48 h 后菌落計數(shù)，繪制生長曲線[15-16]。

2.4 混合菌和單一菌生物被膜中金黃色葡萄球菌毒素基因表達量的差異

2.4.1 混合菌和單一菌生物被膜的建立及總RNA的提取 混合菌生物被膜和金黃色葡萄球菌生物被膜按照2.1 節(jié)的方法建立培養(yǎng)24 h 后，將漂洗干凈的不銹鋼片放入裝有1 mL Trizol 試劑的試管中，振蕩后嚴(yán)格按照Trizol 操作說明提取總RNA，每個樣品3 個平行樣[17]。

2.4.2 熒光定量PCR 相對定量毒素基因

2.4.2.1 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 進行 cDNA反轉(zhuǎn)錄，試驗操作按產(chǎn)品說明書進行。

2.4.2.2 Real Time PCR 樣本檢測 試驗對四大類的28 種金黃色葡萄球菌毒素基因進行熒光定量PCR 反應(yīng)，引物均由北京Invitrogen 公司合成。以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌（CMCC 26003-3）為對照樣品，計算出單一菌和混合菌生物被膜中金黃色葡萄球菌28 種特有毒素基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。每個樣本均做3 個平行樣。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析：

表1 熒光定量PCR 反應(yīng)引物序列Table 1 Primers sequences used for quantitative real-time PCR

（續(xù)表1）

3 結(jié)果與分析

3.1 銀染法對混合菌生物被膜形態(tài)的觀察

圖1為培養(yǎng)0.5，1，3，5，7 d 混合菌生物被膜的形態(tài)，圖中黑色絮狀膜樣物即為生物被膜。由圖1a 可知，在培養(yǎng)0.5 d 時3 種病原菌的混合菌體生長速率較為緩慢，僅形成微量生物被膜且分布比較分散，因為此階段為生物被膜黏附期，為生物被膜形成的第一步，此期的細菌形成量少且狀態(tài)不穩(wěn)定，食品工業(yè)中清除生物被膜常在此階段進行。圖1b 和圖1c 時期的生物被膜形成量多，尤其在培養(yǎng)1 d 時，黑色絮狀物緊密聯(lián)結(jié)在一起形成大片生物被膜，在3 d 時的被膜量雖然有所減少，但仍有小片聯(lián)結(jié)的生物被膜，隨著微生物細胞的不斷分裂增殖，并分泌了大量胞外多聚糖（EPS），此時單個細菌聚集形成微小集落以形成高度有組織的成熟生物被膜。成熟后的生物被膜隨著培養(yǎng)時間的增加，其內(nèi)的微生物細胞會快速增殖分散，致使一部分微生物脫落，如圖1d、1e 所示，生物被膜已呈分散狀態(tài)，僅有微量甚至是單個菌體存在[19]。

圖1 不同時間段混合菌生物被膜的形態(tài)（×200）Fig.1 Morphology of mixed biofilms in different time periods（×200）

3.2 掃描電鏡對混合菌生物被膜形態(tài)的觀察

用掃描電鏡觀察0.5，1，3，5，7 d 的混合菌生物被膜形態(tài)（圖2）發(fā)現(xiàn)，混合菌生物被膜的生長狀態(tài)符合銀染法觀察到的黏附期-成熟期-脫落期三階段。在0.5 d（圖2a）時，微生物以單個形式存在，分布也較為分散；在1 d（圖2b）時3 種病原菌分泌的胞外多糖等物質(zhì)將自身及其余兩種菌包裹后形成大片粘連緊密的生物被膜；由圖2c 可清晰看出膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但此時的生物被膜已稍有松動趨勢；處于脫落期（圖2d、2e）的混合菌生物被膜只可見稀松的單個菌體和細菌分泌的胞外多糖及其它有機物質(zhì)。由圖2可知，在大腸桿菌-金黃色葡萄球菌-腸炎沙門氏菌的混合菌生物被膜中，球狀菌體（金黃色葡萄球菌）明顯大于桿狀菌體（大腸桿菌和腸炎沙門氏菌）數(shù)量，這是因為在混合病原菌生物被膜中，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌存在競爭作用，優(yōu)勢菌（金黃色葡萄球菌）在生長過程中分泌的物質(zhì)會抑制其它兩株菌的生長[20]。

圖2 不同時間段混合菌生物被膜的形態(tài)（×5 000）Fig.2 Morphology of mixed biofilms in different time periods（×5 000）

3.3 結(jié)晶紫染色法對混合菌生物被膜形成量的檢測

采用結(jié)晶紫染色法對混合菌生物被膜形成量進行檢測，結(jié)果見表2。

如表2所示，5 個時間段的SI 均大于1，即混合菌（大腸桿菌-金黃色葡萄球菌-沙門氏菌）在培養(yǎng)0.5，1，3，5 和7 d 均能形成生物被膜。在培養(yǎng)1 d 時為強黏附，混合菌生物被膜SI=4.11；0.5，3，5 d 均可生成中等量生物被膜（2

表2 不同時間段生物被膜的形成能力Table 2 Biofilm formation ability in different time periods

3.4 食源性病原菌生物被膜內(nèi)活菌數(shù)的定量

圖3和圖4為3 種細菌單獨及混合后其生物被膜中各個活菌數(shù)隨時間變化的生長曲線。在單一菌生物被膜中（圖3），大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌生物被膜活菌數(shù)均隨培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且在培養(yǎng)24 h 時活菌數(shù)目達到最大；金黃色葡萄球菌則明顯高于其它兩株。在混合菌生物被膜中（圖4），各個菌株也均于培養(yǎng)24 h 時達到最大生長量，金黃色葡萄球菌在混合菌生物被膜中為優(yōu)勢菌。對比單一菌和混合菌生物被膜中各個活菌數(shù)可知，3 株菌在混合菌生物被膜中為相互競爭關(guān)系，分別通過分泌有機物質(zhì)抑制了其余兩株細菌的生長。以24 h 時來說，混合菌中的金黃色葡萄球菌活菌數(shù)目下降率為26.7%，大腸桿菌為23.2%，沙門氏菌為40.1%。

圖3 單菌生物被膜中活菌數(shù)目Fig.3 Number of bacteria in single bacteria biofilm

圖4 混合菌生物被膜中活菌數(shù)目Fig.4 Number of bacteria in mixed bacteria biofilm

3.5 混合菌和單一菌生物被膜中金黃色葡萄球菌毒素基因表達量的差異

根據(jù)Real Time PCR 原始檢測結(jié)果，按照2-△△CT 相對定量計算，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，28 種毒素基因均可在金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌中檢出。相對于標(biāo)準(zhǔn)菌株，除單一菌中的hla、hld、etd 及混合菌中ser、hld 毒素基因外，其余基因表達量均低于標(biāo)準(zhǔn)菌?；旌暇噍^于單一菌生物被膜，金黃色葡萄球菌毒素基因表達量上調(diào)的有sea、sec、seg、sei、sej、sem、sep、ser、seu、hld、hlg、coa；下調(diào)的基因有sed、see、seh、sek、sel、sen、seo、seq、hla、hlb、pvl、eta、etb、etd、tst；混合菌中上調(diào)量顯著的基因有sep、ser，顯著下降的為hla、etd，其中seb 在單一菌和混合菌生物被膜中的表達量相等。

表3 Real Time PCR 檢測相對定量結(jié)果Table 3 Real Time PCR detects relative quantitative results

金黃色葡萄球菌在感染過程中的主要致病毒素為腸毒素（SEs），SEs 易溶于水且耐高溫，肉蛋乳等淀粉和蛋白質(zhì)含量高的食品易被SEs 污染[21]，因此本研究對18 種調(diào)控腸毒素的因子（sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser 和seu）進行了相對定量，除ser 在混合菌生物被膜中表達量顯著上調(diào)外，其余均比金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌表達量低。金黃色葡萄球菌溶血素（HL）能夠破壞宿主紅細胞從而引發(fā)血小管平滑肌收縮、局部缺血甚至壞死等問題[22]，研究的4 種溶血素調(diào)控因子（hla、hlb、hld 和hlg）檢出率為100%，hla 在單一菌生物被膜中明顯上調(diào)，hld 在單一菌和混合菌中表達量均顯著增加。殺白細胞素（pvl）是金黃色葡萄球菌另一種毒素基因，可破壞宿主吞噬細胞而引發(fā)致死性肺炎[23]，Pvl 在生物被膜中微量下降。脫皮毒素（ETs）、中毒性休克綜合征毒素（TSST）和凝固酶（CaL）為金黃色葡萄球菌的重要致病毒素[24-26]，調(diào)控基因除etd 在單一菌中表達量顯著上調(diào)外，eta、etb、tst 和coa 均下降。

在食品工業(yè)中，金黃色葡萄球菌形成的生物被膜比浮游菌危害性大且更難以清除。雖然試驗檢測出生物被膜中的毒素基因大多比浮游菌的表達量低，但是由ica 操縱子（含icaA、icaB、icaC、icaD 基因）調(diào)控的多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）大量增加，使得生物被膜緊密聯(lián)結(jié)在一起以便抵抗外部不良環(huán)境。混合菌生物被膜因多糖黏附素與復(fù)雜多樣的胞外有機物質(zhì)相互粘連進一步形成了更加完善緊密的微系統(tǒng)，使毒素可長時間作用于宿主且不易被外源藥物殺滅[27-29]。

4 結(jié)論

本研究通過銀染法和掃描電鏡法對食源性混合病原菌生物被膜進行定性檢測，使用結(jié)晶紫染色法對生物被膜的形成量進行測定，并通過平板菌落計數(shù)法對單一菌和混合菌生物被膜中的活菌數(shù)目進行定量。研究表明，混合菌在培養(yǎng)1 d 時即可形成成熟生物被膜；對其活菌數(shù)定量后發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌為優(yōu)勢菌，且其在混合菌生物被膜中生長量明顯低于單一菌；進一步使用熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌28 種毒素因子在混合菌和單一菌生物被膜中表達量各不相同。金黃色葡萄球菌具有強致病性，且極易與其它病原菌形成混合菌生物被膜，增強了其致病性和難清除性。因此，在食品實際加工生產(chǎn)中應(yīng)實時防控和滅菌，避免混合菌生物被膜造成食品細菌性污染等問題。