PCR法分析市售牛肉類制品成分現(xiàn)狀

鄒寒艷 王瑩 尚亞寧 張恩

牛肉制品由于營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格高昂，成為不法商販獲取非法利潤(rùn)的對(duì)象。近些年不斷有媒體報(bào)道牛肉制品的摻假事件，牛肉制品質(zhì)量的良莠不齊，尤其是動(dòng)物源性成分的摻假和造假，對(duì)消費(fèi)者的生活造成了一定的影響。面對(duì)真假難辨的牛肉制品，老百姓僅用感官與經(jīng)驗(yàn)等傳統(tǒng)的食品鑒別方法無法區(qū)分真假牛肉和摻假牛肉，如何鑒別肉類及其制品是否摻假已成為食品安全監(jiān)管和檢測(cè)機(jī)構(gòu)迫切需要解決的問題。

針對(duì)肉制品摻假和冒充等問題，長(zhǎng)期以來，解剖學(xué)、組織學(xué)、顯微鏡學(xué)、感官學(xué)、化學(xué)、電泳、色譜、免疫學(xué)等方法均在肉類鑒定中發(fā)揮著作用。但這些技術(shù)存在特異性差、準(zhǔn)確性低和成本高等問題，存在固有的局限性。目前，食品中動(dòng)物源性成分鑒定主要是運(yùn)用以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)，因?yàn)镈NA在各種加工過程中很穩(wěn)定，并且不同動(dòng)物的DNA具有唯一性，因此以DNA為基礎(chǔ)開發(fā)的PCR技術(shù)，以其靈敏性高、準(zhǔn)確性好和效率高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。

近些年陸續(xù)出臺(tái)了大量以PCR技術(shù)為核心的動(dòng)物源性成分鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本文應(yīng)用PCR技術(shù)，對(duì)從超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和小攤販處隨機(jī)購(gòu)買的145批牛肉制品進(jìn)行動(dòng)物源性成分真?zhèn)握{(diào)查分析，參考的標(biāo)準(zhǔn)是中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)PCR法》、SN/T 2978-2011《動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法》、SN/T 3731.5-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分：鴨成分檢測(cè)PCR法》、SN/T 3730.5-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法》、SN/T 3730.4-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法》。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹵牛肉、生牛肉均檢出牛源性成分；袋裝和散裝牛肉干中分別有1批次和6批次檢出非牛源性成分。這說明市售牛肉制品存在非牛源性成分摻假的情況，尤其是散裝牛肉干制品，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和小攤販的監(jiān)督管理。

一、材料與儀器

1.材料。從市場(chǎng)上選取不同類型的牛肉制品。鹵牛肉來源于超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、小攤販，包裝形式為散裝，共10批。牛肉干來源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、小攤販，包裝形式為散裝，共80批；牛肉干來源于超市，包裝形式為袋裝，共40批。生牛肉來源于超市，包裝形式為袋裝，共5批；生牛肉來源于超市，包裝形式為散裝，共10批。

2.試劑。DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑 盒，牛源性成分檢測(cè)試劑盒，羊源性成分檢測(cè)試劑盒，豬源性成分檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；PCR試劑2xGold easy Mix，購(gòu)自天根生化科技有限公司，引物序列均為華大基因合成。

3.主要儀器。Lightcycler 480II熒光定量PCR儀，美國(guó)Roche公司；Tprofessional梯度PCR儀，德國(guó)Biometra公司；核酸微量分析儀，美國(guó)Thermo公司；Mupid-2 Plus通用電泳儀，日本Mupid公司。

二、實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

1.牛肉制品的DNA提取。利用DNA提取試劑盒提取牛肉制品的DNA，鑒于牛肉干加工過程較為復(fù)雜的情況，在前處理過程中，將牛肉干放入溫水中去除油脂、佐料和鹽分，并對(duì)難以提取的樣品延長(zhǎng)56℃的水浴時(shí)間。在清洗牛肉干時(shí)使用滅過菌的器具，避免交叉污染。DNA提取質(zhì)量（260/280）均在1.7-2.0，濃度是10-200ng/μL，均符合后續(xù)PCR擴(kuò)增需要。

2.鹵牛肉的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)十批鹵牛肉進(jìn)行牛源性成分檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光PCR的CT值均在15-25之間，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，這十批鹵牛肉均含有牛源性成分。進(jìn)行其它成分檢測(cè)時(shí)，不含有其他動(dòng)物源性成分。

3.牛肉干的檢測(cè)結(jié)果。牛肉干袋裝和散裝制品分別進(jìn)行動(dòng)物源性成分（牛源性、豬源性、鴨源性、雞源性、馬源性和驢源性成分）檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，袋裝和散裝牛肉干分別有1批和6批未檢出牛源性成分，1批檢出牛源性成分的袋裝牛肉干中檢出了豬源性成分，2批檢出牛源性成分的散裝牛肉干中檢出了豬源性成分。

4.生牛肉的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)15批生牛肉進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論袋裝還是散裝的制品均含有牛源性成分。進(jìn)行其它成分檢測(cè)，不含有其它動(dòng)物源性成分。

三、討論

對(duì)市場(chǎng)上的牛肉制品進(jìn)行調(diào)查分析后發(fā)現(xiàn)，仍存在以假亂真、以次充好的現(xiàn)象。從檢測(cè)結(jié)果中可以看出，感官可以直接觀察的牛肉制品在本次調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)摻假制品，而在牛肉干中無論是袋裝還是散裝均發(fā)現(xiàn)摻假現(xiàn)象，其中散裝牛肉干制品中出現(xiàn)直接用豬肉冒充牛肉的數(shù)量最多。經(jīng)過來源分析發(fā)現(xiàn)，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和小攤販出現(xiàn)問題制品的現(xiàn)象更多。

從本次分析數(shù)據(jù)中可以看出，未來市場(chǎng)監(jiān)管部門應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)監(jiān)管的牛肉制品是多道工序加工的牛肉干，并可將售賣牛肉干的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和小攤販作為抽查重點(diǎn)，也可聯(lián)合公安部門對(duì)生產(chǎn)劣質(zhì)摻假牛肉制品的黑作坊進(jìn)行依法查處。

近年來，以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)廣泛地被用來鑒定食品中的動(dòng)物源性成分，由于PCR方法比較簡(jiǎn)便，特異性和靈敏度都很高，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)運(yùn)用該技術(shù)和其他技術(shù)結(jié)合建立了多種鑒別動(dòng)物源性成分的方法。在實(shí)際檢測(cè)過程中，DNA質(zhì)量的好壞也會(huì)影響PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，傳統(tǒng)的 SDS法、CTAB法、Chelex-100法在提取深加工食品時(shí)均存在一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)中使用的是Takara的全基因組DNA提取試劑盒，結(jié)合對(duì)深加工樣品油脂和鹽分的沖洗，提取出來的DNA質(zhì)量均在1.7-2.0之間，完全可以滿足PCR檢測(cè)使用。因此建議在提取深加工肉類制品時(shí)使用商業(yè)試劑盒，可以節(jié)省人力和時(shí)間，提高檢測(cè)效率。

隨著PCR方法在肉類制品成分鑒別上的廣泛應(yīng)用，在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)僅依靠CT值的大小來判斷某些復(fù)雜樣品是否含有某種動(dòng)物源性成分較為困難，給檢驗(yàn)增加了大量的工作，比如需要多次更換取樣部位、多次提取DNA、多次PCR實(shí)驗(yàn)等。因此，亟需新技術(shù)的突破。

近幾年，隨著數(shù)字PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，不少學(xué)者已經(jīng)將該技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)物源性成分的鑒別上，為肉制品成分鑒定和摻偽提供了更有利的幫助。相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，肉制品動(dòng)物源性成分方面的摻假造假會(huì)越來越少，老百姓也會(huì)享受到更高質(zhì)量的肉制品。

作者簡(jiǎn)介：鄒寒艷，博士，工程師；研究方向：食品藥品檢測(cè)。

*通信作者：張恩，博士，高級(jí)工程師。