人HtrA1基因的生物信息學分析

王 道，梁波羅

(中南大學湘雅二醫(yī)院婦產科，中國 長沙 410011)

HTRA(High Temperature Requirement Factor A) 是一種熱休克誘導的、與包膜相關的絲氨酸蛋白酶，其具有結合分子伴侶和蛋白酶的雙重活性，能夠識別和降解細胞質中錯誤折疊的蛋白質。HTRA家族由HTRA1，HTRA2，HTRA3和HTRA4組成[1]，共同特點是每個單體包括兩個或者3個主要結構域[2,3]：一個Kazal樣結構域、一個C末端的PDZ域和一個N端IGFBP樣結構域。在人體中，這4種HTRA同源物都參與細胞生長、細胞凋亡、炎癥反應、神經變性、細胞自噬以及惡性腫瘤侵襲轉移等過程[4-7]。

HTRA1是一種非糖基化的絲氨酸蛋白酶，能夠降解多種底物[8]，其中包括細胞外基質蛋白(Extracellular matrix, ECM)。但是, 目前研究人員對人HTRA1蛋白的功能尚不清楚。研究表明[9]，HTRA1能夠與多種TGF-β家族蛋白結合，阻止受體激活來抑制細胞中BMP4，BMP2和TGF-β1等信號分子的傳導；還有報道[10]稱其可通過TGF-β1/SMAD信號通路，調節(jié)細胞分化；Globus等[11]還提出HTRA1可能是WNT/β-catenin信號通路的新成員。

HTRA1廣泛分布在人體正常組織中，涉及許多與人類機體密切相關的疾病，如阿爾茲海默癥[12]、腦血管疾病[13]、年齡相關的黃斑變性[14]、癌癥[15]和骨關節(jié)炎[16]。在骨關節(jié)炎中，盡管人HTRA1在軟骨細胞和成骨細胞中表達[17]，但其是成骨細胞的正調控劑還是負調節(jié)劑存在爭議[18]。越來越多的證據也表明，人HtrA1基因在多種腫瘤疾病中起著抑癌的作用[19]，包括乳腺癌、胃癌和肝細胞癌。此外，還有研究認為HtrA1在卵巢癌、子宮內膜癌進展和侵襲過程中被下調[20]。研究人員還證實，隨著年齡增長，HtrA1基因的啟動子變異可能導致老年黃斑變性[21]，這些都暗示我們有必要對人HtrA1基因進行研究。

本研究對人HtrA1基因的編碼蛋白序列進行同源性分析，對其理化性質、結構特征和亞細胞定位進行預測，并推導出與人HTRA1蛋白發(fā)生相互作用的網絡圖，然后通過GO (Gene Ontology) 基因本體注釋人HtrA1在機體中的重要生物學功能，最后比較其在不同腫瘤中的表達差異。

1 材料與方法

1.1 材料

人HtrA1基因的核酸序列信息從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站獲取(Accession number: NM-002775.5)，氨基酸序列信息均來自Uniprot (http://www.uniprot.org)網站：智人(Q92743)、斑馬魚(Q6GMI0)、小家鼠(Q9R188)、牛(F1N152)、褐家鼠(Q9QZK5)、非洲爪蟾(A6YFB5)、家犬(F1PU95)、家貓(M3W0Q9)、黑猩猩(H2Q2P9)、獼猴(H9FX91)、雞(A0A1D5PSR5)。

1.2 方法

1.2.1HtrA1編碼蛋白的同源性分析和進化樹構建 從Uniprot網址選擇11種具有代表性的物種，利用Clustal Omega及MEGA 10.0等軟件對不同物種的氨基酸序列進行同源性分析和進化樹構建。

1.2.2HtrA1的生物信息學預測和分析 運用多種數據庫及在線網站分析人HTRA1的理化性質、信號肽、亞細胞定位、二/三級蛋白結構、蛋白互作網絡、GO注釋功能和不同腫瘤中的表達量差異(如表1所示)。

表1 運用的數據庫和軟件信息

2 結果與分析

2.1 人HtrA1基因編碼蛋白的同源性預測分析

通過Uniprot數據庫獲取不同物種HTRA1蛋白序列，利用Clustal軟件進行同源比對分析(圖1A)。結果顯示，人(Homosapiens)與黑猩猩(Macacamulatta)、獼猴(Pantroglodytes)、斑馬魚(Daniorerio)、家貓(Feliscatus)、家犬(Canislupus)、牛(Bostaurus)、雞(Gallusgallus)、小家鼠(Musmusculus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)以及非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的HTRA1蛋白序列的同源性分別是91.762%，99.168%，70.515%，95.868%，68.958%，93.84%，78.719%，92.292%，91.875%及64.108%。另外，進化樹結果顯示，HTRA1在哺乳動物中的親緣關系較近，具有高度的保守性。人與黑猩猩、獼猴的親緣性最近，而與雞、非洲爪蟾以及斑馬魚的距離較遠。總之，11個物種之間的同源性高達77.84%，推測人HtrA1是一個高度保守的基因。

2.2 人HTRA1蛋白的理化性質預測分析

使用ProtParam預測分析了人HTRA1蛋白的理化性質，發(fā)現該蛋白由480個氨基酸組成，其中丙氨酸46個占9.6%，精氨酸31個占6.5%，包括58個帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)和55個帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)；分子式為C2232H3668N652O684S22；相對分子質量為51 286.95；等電點為8.09；280 nm波長處消光系數為11 430；吸光度為0.223；半衰期為30 h；穩(wěn)定系數為43.30；疏水值為94.69，平均親水性為-0.121。

2.3 人HTRA1蛋白的親/疏水性預測分析

利用ProtScale數據庫對HTRA1蛋白親水性進行分析。結果顯示，HTRA1蛋白存在9個高分值峰區(qū) (Score值>1.5)，分別位于氨基酸的第9～18位、第91位、第93～94位、第109位、第111位、第205位、第218位、第282～283位以及第351位氨基酸，其中第12位氨基酸的亮氨酸分值最高(Score值=3.200)；HtrA1蛋白存在8個低分值 (Score值<-2) 的峰區(qū)，這些峰區(qū)分別位于第53位、第137位、第140～142位、第160位、第163～166位、第302位、第369～372位、第397～403位，其中第400位的天冬氨酸 (Score值=-2.967)分值最低。分析可知，人HtrA1蛋白存在大量疏水區(qū)，是一種疏水性蛋白(圖2)。

圖2 人HTRA1親/疏水性分析預測

2.4 人HTRA1蛋白信號肽及亞細胞定位預測分析

提交人HTRA1氨基酸序列到SignalP 4.1進行在線預測分析，設置Cut-off值為0.450。分析結果顯示(圖3)，C，Y及S 最大值位點為23，23及15，C，Y及S的最大值分別為0.883，0.917及0.982，S-mean (1-22)和D (1-22)值分別為0.952和0.936，得分都大于0.450，提示在第22和23位氨基酸之間存在酶切位點，推測人HTRA1蛋白存在信號肽。

圖3 人HTRA1信號肽分析預測

通過Genecards分析人HTRA1蛋白的亞細胞定位，預測分析顯示，人HTRA1蛋白主要分布在質膜外，其次是質膜和胞液，如圖4所示。人HTRA1蛋白可能起始在核糖體先合成，露出N-端信號肽序列后停止翻譯，并在信號識別顆粒等因子協助下?？吭趦荣|網繼續(xù)翻譯，通過膜泡運到胞外，作為分泌性蛋白發(fā)揮生物學功能。

圖4 人HTRA1亞細胞定位的分析預測

2.5 人HTRA1蛋白質二級結構預測分析

使用PSIPRED在線分析網站，對人HTRA1的二級結構進行分析。結果顯示，人HTRA1蛋白共有61個α-螺旋，有112個β-折疊。α-螺旋占12.70% (61/480)，β-折疊占23.33% (112/480)，其余為無規(guī)則卷曲，人HTRA1蛋白中超過半數的氨基酸處于無序狀態(tài)(圖5)。

圖5 人HTRA1蛋白二級結構的分析預測

2.6 人HTRA1蛋白三級結構預測分析

Swiss-Model對人HTRA1三級蛋白結構模型進行同源建模預測，分別得到4種預測模型。與其相應模板的主要重疊區(qū)分別在第162～478位氨基酸、第170～479位氨基酸、第36～154位氨基酸、第36～157位氨基酸。對比分析4種模型峰圖可知，模型A的峰圖波形最穩(wěn)定，說明模型A更穩(wěn)定可靠(圖6A和B)。

運用拉曼光譜圖進一步證實HTRA1蛋白的三級結構模型的可靠性。模型A的結果顯示，90.0%的氨基酸殘基位于紅色區(qū)域內，黃色區(qū)域內存在9.1%的氨基酸殘基，只有第223位蘇氨酸殘基與第431位天冬酰胺殘基位于其他區(qū)域，說明模型A中95.79%的氨基酸具有合理的二面角，提示模型A最可靠(圖6C)。

圖6 人HTRA1蛋白三級結構的分析預測(A.三級結構模型;B.波峰相似同源蛋白;C.拉曼光譜圖)

2.7 與人HTRA1蛋白有相互作用的蛋白預測分析

String 11.0 在線預測與人HTRA1有相互作用的蛋白，結果給出了得分前10的蛋白質以及相互作用網絡(圖7)和詳細得分信息(表2)。其中，ACAN蛋白參與構建細胞外基質，YME1L1，CLPX，CLPP及HSPD1等蛋白在生物機體的過程中發(fā)揮重要調節(jié)功能。

圖7 人HTRA1蛋白相互作用預測

表2 人HtrA1蛋白相互作用預測信息

2.8 人HTRA1蛋白功能GO注釋分析

Gene Ontology Consortium 數據庫從細胞組成(cellular component, cc)、分子功能(molecular function, mf) 和生物學過程(biological process, bp)對人HTRA1蛋白進行分析。細胞組分結果說明，人HTRA1蛋白主要定位在線粒體基質和內膜，另外在線粒體外也有大量分布，與人HTRA1的亞細胞定位預測相吻合；分子功能結果顯示，人HTRA1蛋白具有ATP酶活性、水解酶活性、結合活性與蛋白形成二聚體；還參與了蛋白水解、蛋白代謝和大分子分解代謝等重要的生物學過程(表3)。

表3 人HTRA1蛋白GO注釋分析

2.9 人HtrA1基因在不同腫瘤中的表達量分析

cBioPortal數據庫收集了來自腫瘤基因組圖譜(TCGA) 30多種癌癥類型的信息，筆者對人HtrA1基因進行表達量分析。結果表明，除在急性髓系白血病中的表達量較低之外，該基因在肉瘤、間皮瘤、腦級別膠質瘤表達量最高，其次是乳腺浸潤癌、多形成性膠質細胞瘤、肝細胞癌以及卵巢癌等，表達量默認值x取以2為底的對數(log2x)進行數據分析(圖8)。

圖8 人HtrA1基因RNA表達量分析

3 討論

關于人HtrA1基因，學者研究都集中在炎癥或者腫瘤發(fā)生和進展中的作用，例如人HtrA1在骨關節(jié)炎患者的軟骨中濃度顯著升高[22]；HTRA1蛋白的表達發(fā)生變化，在一些侵襲力強的惡性腫瘤中，如黑素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌等，尤其在轉移性癌癥中，HtrA1基因的表達下調[23-25]。一些研究證實[26,27]，HtrA1表達下調可減少癌細胞的遷移和抑制生長。所以，HtrA1在癌細胞的增殖、遷移、侵襲以及分化過程起關鍵作用[28,29]。但是，關于人HtrA1基因編碼的蛋白從基本理化性質到相互作用網絡和GO功能注釋的報道很少，本研究有利于提高我們對HTRA1蛋白結構和理化性質的認識，闡明其在人類機體發(fā)揮的重要作用。特別是在不同腫瘤組織樣本之間發(fā)現人HtrA1存在差異表達，筆者推測可能與腫瘤類型、組織學分級、轉移和細胞分化程度等因素有關，提示該標記物或許能夠用于鑒定腫瘤起源組織、評估復發(fā)風險和預后藥物治療的效果。

本研究的序列比對結果表明，不同物種之間HTRA1蛋白序列的相似度較高。人HTRA1屬于一個高度保守性蛋白，早期研究證實從細菌到人該蛋白序列具有高度保守性，都含有絲氨酸蛋白酶結構或PDZ結構域[30]。筆者推測，HTRA1蛋白酶是一個嚴格調節(jié)蛋白水解的復合體，核心調控元件具有高度相似性，調控開關的結構可能是臨床干預疾病的基礎。此外，人HTRA1還含有信號肽，屬于一種分泌性蛋白。An等[31]研究表明，HTRA1分泌到細胞外能夠消化包括簇蛋白在內的幾種細胞外蛋白質，其在體外還能夠裂解為幾種蛋白如核心蛋白聚糖、肌動蛋白、波形蛋白等[32], 提示臨床上可能存在通過合適的效應分子調節(jié)蛋白酶活性的有效途徑。筆者預測的蛋白三級結構表明模型A具有最合理的二面角，也是蛋白酶激活機制的結構基礎。本文推測人HTRA1是一種內外功能穩(wěn)定的分子調控劑，與之前Cabrera等[33]提出人HTRA1的三聚體結構對維持變構激活非常關鍵的推論相一致，對于理解其結構生物學和致病機理中的相關性尤為重要。

蛋白質相互作用網絡圖進一步解釋了人HTRA1蛋白參與骨關節(jié)炎、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展過程的機制。結果顯示，ACAN，ARMS2，CLPP及CTRC等與人HTRA1蛋白發(fā)生相互作用，而ACAN與HTRA1蛋白關系最強。Rakic等研究[34]認為在軟骨中HtrA1能夠抑制TGF-β家族信號，介導BMP-2再分化，從而增加軟骨細胞中ACAN和COL1A1等的表達；Huang等[35]在中國不同人群中證實CFH，ARMS2和HTRA1相互作用，涉及到新生血管性黃斑變性疾病的形成，與圖7所示蛋白網絡圖結果相符。Poulse等[36]證實HTRA1有效切割轉化生長因子-β-誘導蛋白(TGFBIP)，與GO功能分析認為人HTRA1發(fā)揮內肽水解酶作用是一致的；Muoz等[37]還揭示其可以調節(jié)載脂蛋白E(ApoE)的生物活性，參與蛋白水解等相關代謝過程?？傊?，HTRA1蛋白可以通過與多種蛋白相互作用，發(fā)揮其關鍵的生物學功能。

綜上所述，本文通過多種生物信息學數據庫進行分析，將有助于后續(xù)研究人HtrA1基因在復雜疾病中的調控機制，但是預測結果還需要在臨床研究中得到更多的實驗驗證。