張淑紅

（唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter）是在生物界廣泛存在的、能夠催化腺苷三磷酸（ATP）水解并利用水解所產(chǎn)生的能量促使底物實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一類膜整合蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)超過(guò)了100 種，它們廣泛存在于各類細(xì)胞器，并被證實(shí)在多個(gè)領(lǐng)域中均發(fā)揮著重要作用[1-3]。在致病真菌中，多向耐藥性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（multidrug resistance protein，MDR）是近年來(lái)越來(lái)越多的抗真菌藥物治療效果明顯下降的最主要原因[4]。

Mlt1 蛋白是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超級(jí)家族成員，通過(guò)對(duì)白色念珠菌（Candida albicans）Mlt1 突變體的轉(zhuǎn)錄譜分析，發(fā)現(xiàn)參與內(nèi)吞作用、氧化還原酶活性、毒力和菌絲發(fā)育的基因被下調(diào)[5]。在植物病原真菌中Mlt1 是細(xì)胞壁完整性（CWI-MAPK）信號(hào)通路的起始蛋白[6]。CWI-MAPK 信號(hào)通路是植物病原真菌中普遍存在的一條保守通路，在生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和對(duì)逆境脅迫的感受和調(diào)節(jié)中均具有重要作用。玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）是玉米生產(chǎn)過(guò)程中重要的葉部病原真菌，引起的玉米大斑病嚴(yán)重年份可造成減產(chǎn)50%以上[7]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析玉米大斑病菌Mlt1 同源蛋白StMlt1 的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能，旨在為進(jìn)一步研究StMlt1 在玉米大斑病生長(zhǎng)和致病過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

利用酵母Mlt1 蛋白的氨基酸序列對(duì)玉米大斑病菌基因組（https://genome.jgi.doe.gov/portal/）進(jìn)行Blastp 比對(duì)分析，獲得玉米大斑病菌Mlt1 同源蛋白StMlt1 的氨基酸序列。利用在線軟件ExPASy-ProtParam 進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用在線軟件Predict Protein 和NPS@SOPMA 進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析；利用在線軟件SWISS-MODEL和PROCHECK 進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和驗(yàn)證；通過(guò)JGI 數(shù)據(jù)庫(kù)的GO 進(jìn)行功能預(yù)測(cè)；利用在線軟件uniprot 獲得多個(gè)植物病原真菌Mlt1 同源蛋白的氨基酸序列；利用軟件MEGA7.0 鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌Mlt1 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

StMlt1 蛋白含有1 543 個(gè)氨基酸殘基，不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白；疏水性為0.021，屬于疏水性蛋白；等電點(diǎn)為8.55，屬于堿性蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，其中α-螺旋含量最高，達(dá)到54.70%。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果見圖1，其中區(qū)域L 為低復(fù)雜度區(qū)域，區(qū)域T 為跨膜螺旋區(qū)域。結(jié)構(gòu)域AAA 包含了一個(gè)ATP 酶，AAA-ATP 酶與多種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)，參與膜融合、蛋白水解和DNA 復(fù)制等細(xì)胞過(guò)程。

圖1 StMlt1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，得到9 個(gè)StMlt1 蛋白模型，選取可信度最高的3 個(gè)模型進(jìn)行在線驗(yàn)證，結(jié)果顯示模型1（可信度為95%）和模型3（可信度為83%）可驗(yàn)證通過(guò)，如圖2 所示。

圖2 StMlt1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（左：模型1；右：模型3）

2.2 玉米大斑病菌Mlt1 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，StMlt1 蛋白定位于液泡膜（如圖3 所示），不含核定位信號(hào)。

圖3 StMlt1 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.3 玉米大斑病菌Mlt1 蛋白功能預(yù)測(cè)

GO 功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，StMlt1 的分子功能表現(xiàn)為ATP 酶活性與物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)的耦合、ATP 酶活性和ATP 連接；在生物過(guò)程方面行使轉(zhuǎn)運(yùn)功能；在細(xì)胞成分方面作為膜成分。

2.4 StMlt1 蛋白的保守性和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析

玉米大斑病菌23 號(hào)小種菌株et28a 和1 號(hào)小種菌株ny001 的StMlt1 蛋白的氨基酸序列僅相差1 個(gè)氨基酸，說(shuō)明StMlt1 在菌株間非常保守。在氨基酸序列1 535 位置處，菌株et28a 的Ala 代替ny001 的Ser，該位置不處于保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，與跨膜和ATP 酶功能無(wú)關(guān)。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖4 所示。玉米大斑病菌StMlt1 蛋白與小麥黃斑病菌（Pyrenophora teres）和大麥網(wǎng)斑病菌（Pyrenophora tritici-repentis）的Mlt1 同源蛋白遺傳關(guān)系最近。

圖4 StMlt1 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

典型的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一般包括4 個(gè)核心結(jié)構(gòu)域：兩個(gè)具有多個(gè)α-螺旋的疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD），兩個(gè)嵌于細(xì)胞膜但突出于細(xì)胞質(zhì)的催化ATP 水解的親水核苷酸結(jié)合域（NBD）[10]。大多數(shù)的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠借助水解ATP 釋放的能量實(shí)現(xiàn)對(duì)各類物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的一系列生理活動(dòng)[11]。在真菌基因組中存在著許多編碼ABC 蛋白的基因，每種ABC 家族的成員都有不同的生理角色。白色假絲酵母、新型隱球酵母、煙曲霉等致病真菌中，多向耐藥性ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究已經(jīng)取得重要進(jìn)展[4]。研究顯示，白色念珠菌的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體Mlt1 定位于液泡膜，能特異地將磷脂酰膽堿（PC）轉(zhuǎn)運(yùn)到空泡腔內(nèi)。Mlt1蛋白的水平會(huì)影響脂質(zhì)的同質(zhì)性，導(dǎo)致過(guò)多的生理紊亂[5]。目前關(guān)于植物病原真菌Mlt1 蛋白的研究還未見報(bào)道，本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)玉米大斑病菌Mlt1 的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能及進(jìn)化關(guān)系，對(duì)于研究該蛋白在玉米大斑病致病方面的作用有著重要意義。