呂志勇，姚開虎，宋文琪，董 方，甄景慧，孟慶盈，蘇建榮

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100050； 2. 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心，北京 100045； 3. 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 北京市兒科研究所 兒科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科 教育部?jī)嚎浦卮蠹膊⊙芯恐攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100045)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)是兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要病原菌，為條件致病菌，可引起肺炎、鼻竇炎、中耳炎等非侵襲性疾病以及腦膜炎、敗血癥、胸膜炎等侵襲性疾病(invasive pneumococcal disease，IPD)。青霉素是臨床治療肺炎鏈球菌感染的首選藥物，隨著抗菌藥物的廣泛使用，肺炎鏈球菌的耐藥率不斷升高，給肺炎鏈球菌感染的治療帶來了挑戰(zhàn)，尤其是侵襲性肺炎鏈球菌感染的治療挑戰(zhàn)更嚴(yán)峻。侵襲性肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病負(fù)擔(dān)沉重，且可造成持久不良后果。了解侵襲性肺炎鏈球菌感染的臨床特征，肺炎鏈球菌血清型及對(duì)抗菌藥物的耐藥特點(diǎn)，可為疫苗設(shè)計(jì)、免疫策略和臨床預(yù)防提供數(shù)據(jù)支持。本研究回顧性分析2014年1月—2018年12月74例侵襲性肺炎鏈球菌感染患兒的臨床資料、藥敏試驗(yàn)和血清分型結(jié)果，分析感染患兒的臨床特征，對(duì)抗菌藥物的耐藥性，以及疫苗對(duì)其血清型覆蓋的情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2014年1月—2018年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院收治的無菌部位(血液、腦脊液、胸腔和腹腔積液、硬膜下積液)分離出肺炎鏈球菌，并有完整的住院病歷記錄的侵襲性肺炎鏈球菌感染患兒，回顧性收集患兒的臨床資料，包括性別、年齡、患病季節(jié)、臨床表現(xiàn)和預(yù)后等。

1.2 菌種來源 研究對(duì)象無菌部位標(biāo)本中分離的肺炎鏈球菌，剔除同一患兒標(biāo)本中分離的重復(fù)菌株。若患兒血及腦脊液標(biāo)本中均分離出肺炎鏈球菌，則將腦脊液分離株納入分析；若患兒血和胸腔積液標(biāo)本同時(shí)分離出肺炎鏈球菌，則將血標(biāo)本分離株納入分析。

1.3 菌株培養(yǎng)方法 參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[1]進(jìn)行操作，將胸腔積液，耳后硬膜下積液和腹腔積液標(biāo)本接種于哥倫比亞血平板，37℃ 5% CO2孵育16～18 h。血標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本注入血培養(yǎng)瓶，放入BD BACTEC FX血培養(yǎng)儀，儀器報(bào)陽后轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板37℃ 5% CO2孵育16～18 h。

1.4 菌株分離與鑒定 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，根據(jù)典型菌落形態(tài)進(jìn)行Optochin試驗(yàn)，初篩陽性菌株，使用美國(guó)BD公司Phoenix 100 全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行菌株鑒定。

1.5 血清型分型 采用莢膜腫脹試驗(yàn)進(jìn)行血清型分型，分型試劑盒Pneumotest kit和分型特異性血清購(gòu)自丹麥血清研究所。

1.6 藥敏檢測(cè) 回顧性分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果，按照2020年臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC 49619。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用WHONET 5.6和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(P25,P75)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher’s確切概率法，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入74例侵襲性肺炎鏈球菌感染患兒，其中男性38例，女性36例，男女比例為1.06∶1。年齡為2.0(0.92，3.0)歲，其中腦膜炎組年齡為2.5(0.95，3.0)歲，非腦膜炎組年齡為2.0(0.83，3.0)歲?；純耗挲g分布主要為幼兒期(1～3 歲，占55.4%),其次為嬰兒期(<1 歲，占24.3%)。感染部位以單部位血液為主(占44.6%)，但兩個(gè)部位感染者占28.4%。感染季節(jié)以春季為主(占32.4%)，其次為冬季(占28.4%)。見表1。

表1 74例侵襲性肺炎鏈球菌感染患兒的臨床資料

2.2 血清型分布 74株肺炎鏈球菌分為13種血清型，其中血清型19F的檢出率最高，占36.5%(27株),其次為血清型19A(21.6%，16株)、血清型14(14.9%，11株)、血清型23F(8.1%，6株)，其他血清型占18.9%(14株)。腦膜炎組與非腦膜炎組肺炎鏈球菌血清型均以19F檢出率最高，各年齡組肺炎鏈球菌血清型除學(xué)齡期組外，其余組均以19F和19A檢出率最高。見表2。

2.3 疫苗覆蓋情況 肺炎鏈球菌疫苗PCV7對(duì)肺炎鏈球菌菌株的總覆蓋率為63.5%，PCV13的覆蓋率為97.3%。其中PCV7對(duì)分離自腦脊液和非腦脊液菌株的覆蓋率分別為59.1%、65.4%； PCV13對(duì)分離自腦脊液菌株和非腦脊液菌株的覆蓋率為100.0%、96.2%。見表2。

表2 兒童侵襲性肺炎鏈球菌不同來源分離株血清型分布及疫苗覆蓋情況

2.4 藥敏結(jié)果 74株肺炎鏈球菌中，包括32株青霉素敏感肺炎鏈球菌(PSSP)和42株青霉素不敏感肺炎鏈球菌(PNSP),未檢測(cè)出對(duì)利奈唑胺、萬古霉素、莫西沙星和左氧氟沙星耐藥的菌株，對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥率高，耐藥率>96%。非腦脊液標(biāo)本分離株中，26株對(duì)青霉素敏感，22株對(duì)青霉素中介，4株對(duì)青霉素耐藥；對(duì)頭孢噻肟、頭孢吡肟、美羅培南的耐藥率分別為23.1%、26.9%、63.5%。腦脊液標(biāo)本分離株中，6株對(duì)青霉素敏感,16株對(duì)青霉素耐藥。腦脊液分離的耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)菌株，對(duì)青霉素、頭孢吡肟和美羅培南的耐藥率>75%，對(duì)頭孢噻肟和氯霉素的耐藥率分別為37.5%、6.3%；腦脊液分離的PSSP菌株對(duì)所有測(cè)試抗菌藥物除四環(huán)素、紅霉素和克林霉素外均敏感。對(duì)青霉素、頭孢吡肟和美羅培南的耐藥率，腦脊液分離株與非腦脊液分離株比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 肺炎鏈球菌對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果

表4 不同血清型肺炎鏈球菌對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果

2.6 轉(zhuǎn)歸與預(yù)后 62例患兒痊愈出院，10例患兒死亡，2例患兒未治愈放棄治療出院。直接死因?yàn)檎砉谴罂尊藁蚧撔阅X膜炎繼發(fā)枕骨大孔疝。

3 討論

肺炎鏈球菌可正常定植于鼻咽部，屬于條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)可引起中耳炎、鼻竇炎等非侵襲性疾病，若細(xì)菌入血可引起更嚴(yán)重的菌血癥、敗血癥和骨髓炎等IPD[2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，全球每年約160萬人因肺炎鏈球菌感染而死亡，而5歲以下兒童的死亡人數(shù)約為70萬～100萬，已成為兒童健康的主要威脅[3]。

IPD存在年齡相關(guān)易感性，主要侵犯6月齡～2歲的嬰幼兒[4]。本研究肺炎鏈球菌感染病例中1歲以下患兒占比為24.3%，3歲以下患兒占比79.7%，6歲以下患兒的占比更是達(dá)到93.2%,與WHO有關(guān)發(fā)展中國(guó)家以幼兒發(fā)病率高的報(bào)道[5]相符。隨著兒童自身免疫水平的提高，3歲以上患兒肺炎鏈球菌感染率逐漸下降，但由于IPD的病情復(fù)雜且致死率更高，已引起全球健康工作者的重視。本研究患兒患病季節(jié)以春季和冬季為主，與有關(guān)文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道結(jié)果相似，但與深圳地區(qū)的報(bào)道[8]不同，表明不同地區(qū)IPD的流行季節(jié)存在差異。IPD多見于血流感染及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[9]，本研究中單一血流感染的患兒為33例(44.6%)，為最常見的感染類型，高于國(guó)內(nèi)一項(xiàng)IPD多中心研究中血流感染的占比(20.4%)[10]。本研究中血流感染占比高，可能與臨床醫(yī)生病原學(xué)檢測(cè)意識(shí)提高，血培養(yǎng)采集時(shí)間合理、送檢及時(shí)，以及與微生物室檢驗(yàn)人員大量的臨床溝通有關(guān)。存在基礎(chǔ)疾病的患兒IPD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高，特別是免疫抑制、血液腫瘤[11]以及先天性心臟病的患兒。本研究中發(fā)現(xiàn)血液系統(tǒng)疾病以及先天性心臟病患兒更易發(fā)生IPD，提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)血液腫瘤以及先天性心臟病患兒的疾病管理，降低肺炎鏈球菌感染發(fā)生率。

肺炎鏈球菌外表面附著一層不易著色的莢膜，是其重要的致病因子，莢膜具有群、型特異性，根據(jù)肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)構(gòu)差異，目前可將肺炎鏈球菌劃分為46個(gè)血清群和90多個(gè)血清型。本研究中腦膜炎分離株與非腦膜炎分離株均以血清型19F、19A、14和23F為主，各年齡組血清型分布也以19F、19A、14和23F為主。尤其以19F的占比最高，與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)[12]報(bào)道結(jié)果相似，也有報(bào)道[13]蘇州地區(qū)人群以血清型6、19F和14為主。國(guó)外研究表明，肺炎鏈球菌血清型美國(guó)主要以血清型35B為主[14]，加拿大主要流行血清型為19A、7F和3[15]，德國(guó)地區(qū)流行血清型為14、3、7F、1和23F[16],日本流行血清型為6B、23F和19F[17]，與本研究結(jié)果有較大差異，不同國(guó)家、不同地區(qū)的肺炎鏈球菌血清型流行情況不同，存在明顯的地區(qū)差異。肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗是目前預(yù)防肺炎鏈球菌感染最主要的措施，疫苗的設(shè)計(jì)基于肺炎鏈球菌莢膜多糖的群、型特異性。應(yīng)用于兒童的疫苗主要是7、10和13價(jià)疫苗(PCV-7，PCV-10，PCV-13)，而應(yīng)用于成人的是23價(jià)肺炎球菌純多糖疫苗(PPV-23)。PCV-7對(duì)本研究中分離自腦脊液和非腦脊液分離株的覆蓋率均低于PCV-13，因PCV-13包含了本院占比第二高的血清型19A。目前常見的肺炎鏈球菌疫苗PCV13涵蓋了占比最高的四種血清型，對(duì)腦脊液分離株及非腦脊液分離株的覆蓋率達(dá)100.0%和96.2%，說明推廣疫苗接種對(duì)肺炎鏈球菌侵襲性感染的預(yù)防會(huì)起到十分明顯的效果。值得注意的是，學(xué)齡期患兒組中這4種常見血清型的構(gòu)成比明顯下降，而除此以外的其他血清型比例則明顯升高。此現(xiàn)象一方面反映了疫苗接種在降低疫苗覆蓋血清型的流行率方面非常成功，另外一方面也說明了肺炎鏈球菌血清型重排現(xiàn)象，及非疫苗血清型(non-vaccine types,NVT)與其所致的IPD比例有所增高[18]。此現(xiàn)象能夠?qū)γ绹?guó)在進(jìn)行PCV-7免疫接種數(shù)年后，非疫苗覆蓋血清型19A比例升高的現(xiàn)象作出合理的解釋。同樣的情況，歐洲國(guó)家在引進(jìn)肺炎鏈球菌7價(jià)疫苗(PCV-7)后，血清型 19A、7F、3和1成為流行的主導(dǎo)血清型[19]。因此，在推廣肺炎鏈球菌疫苗接種的同時(shí)，也應(yīng)監(jiān)測(cè)血清型的變化,為新疫苗的研發(fā)及衛(wèi)生策略的調(diào)整提供數(shù)據(jù)支持。

青霉素是治療肺炎鏈球菌感染的首選藥物，但隨著臨床治療上抗菌藥物的大量使用，肺炎鏈球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率在逐漸升高，給臨床治療干預(yù)帶來了嚴(yán)峻考驗(yàn)[20]。非腦脊液分離的PRSP和PISP檢出率分別為7.7%、42.3%,高于2018年CHINET監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的1.7%、8.9%[20]，腦脊液分離的PRSP和PSSP檢出率分別為72.7%、27.3%，高于2018年CHINET監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的24.6%、24.2%[21]。本院PRSP和PISP的檢出率高與收治來自全國(guó)各地重癥患兒有關(guān)，且轉(zhuǎn)院的患兒很大一部分在首診醫(yī)院進(jìn)行過抗菌藥物治療。肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的主要耐藥機(jī)制是細(xì)菌細(xì)胞壁上青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的構(gòu)象發(fā)生改變，使其與抗菌藥物親和力發(fā)生改變，導(dǎo)致對(duì)青霉素不敏感。肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素的高耐藥率提示大環(huán)內(nèi)酯類抗生素已不能作為治療鏈球菌感染時(shí)青霉素的替代藥物。本研究未檢出對(duì)利奈唑胺和萬古霉素耐藥的菌株，與既往報(bào)道[22]結(jié)果一致。氯霉素和喹諾酮類抗菌藥物(莫西沙星、左氧氟沙星)的敏感率均大于95%，但喹諾酮類藥物可對(duì)兒童軟骨發(fā)育造成不良影響，因此兒童禁止使用。

本研究提示肺炎鏈球菌血清型和耐藥性有一定的相關(guān)性，與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道[23-24]一致。不同血清型的肺炎鏈球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性有明顯差異，流行率越高的血清型其耐藥率往往也偏高，與其暴露于抗菌藥物的頻率增加有關(guān)，從而更易引發(fā)菌種變異及耐藥率的升高。

綜上所述，肺炎鏈球菌感染多見于嬰幼兒，可引發(fā)多種IPD，通過接種疫苗可獲得預(yù)防效果。非腦脊液分離的肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感性好，尤其是青霉素，但對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率總體上在逐年升高，多重耐藥模式也日趨顯著，不同血清型菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥率存在一定的差異，流行率高的血清型往往表現(xiàn)出更高的耐藥性。因此，在臨床工作中應(yīng)加強(qiáng)肺炎鏈球菌的培養(yǎng)鑒定和耐藥性的監(jiān)測(cè)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用抗菌藥物。