卡得了亞·哈依沙爾，得麗扎爾·熱合曼，王中香，孫素榮，李軼杰

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046)

0 引言

宮頸癌（Cervical Cancer）是婦女最常見的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥死亡的第四大病因，超過85%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1].最近幾十年以來，放療聯(lián)合順鉑（DDP）化療是晚期宮頸癌治療的全球標準，但五年58%無進展生存率和66%的總生存率促使研究者探索更好的治療策略，包括改良化療、靶向藥物治療和免疫療法[2].研究顯示免疫療法與放化療聯(lián)合使用，可能改善局部控制和增強全身反應(yīng)，故探討免疫療法與化療在局部晚期和轉(zhuǎn)移性宮頸癌中聯(lián)合作用已成為提高宮頸癌療效的新方向[2].大多數(shù)宮頸癌都由16和18等高危型人乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）持續(xù)感染導(dǎo)致[1].雖然HPV預(yù)防性疫苗已經(jīng)成功上市，但此類預(yù)防疫苗僅對有限的HPV亞型提供保護性免疫，而對數(shù)以百萬已經(jīng)感染HPV的患者沒有治療作用.HPV16型等高危型早期蛋白中的E7是宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵蛋白，也是免疫治療中理想的靶抗原[3].前期我們構(gòu)建的原核表達改造后的HPV16 E7，真核表達鼠白細胞介素12（Interleukin-12，IL-12）的乳酸乳球菌疫苗LL-E7P-IL-12D免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生HPV16 E7特異性免疫應(yīng)答，并在體內(nèi)獲得抑制腫瘤生長的保護效果[4].然而，腫瘤組織未消退的荷瘤小鼠最終還會因緩慢生長的腫瘤導(dǎo)致死亡，其抗腫瘤效果有待進一步增強.順鉑是臨床上常見的具有細胞毒性的細胞周期非特異性藥物[5]，可以抑制腫瘤細胞的DNA復(fù)制過程和損害腫瘤細胞的膜結(jié)構(gòu)，具有較強的抗腫瘤作用[6].本文探討順鉑與HPV16 E7乳酸乳球菌疫苗聯(lián)用是否能夠提高抗腫瘤效果.

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI Medium 1640 basic細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS、100×青鏈霉素混合液購自Hyclone公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；γ-干擾素(IFN-γ)、IL-10，IL-12酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢博士德公司；順鉑購自上海源葉生物科技有限公司；其他實驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.8～10周齡的雌性C57BL/6小鼠購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.HPV16 E7轉(zhuǎn)化的C57BL/6肺上皮細胞TC-1，攜帶人乳頭狀瘤病毒16型E7蛋白和小鼠IL-12 DNA的乳酸乳球菌HPV16 E7疫苗（LL-E7P-IL-12D，357），原核表達紅色熒光蛋白和真核表達增強型綠色熒光的乳酸乳球菌（LL-RP-GD，358）由實驗室凍存.

1.2 方法

1.2.1 動物荷瘤模型的建立與處理

用磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS）將HPV16 E6E7相關(guān)TC-1腫瘤細胞懸液稀釋為1×106個/mL后，在C57BL/6小鼠右后背部皮下按1×105/100μL每只注射TC-1細胞，獲得荷瘤小鼠模型.小鼠皮下腫瘤直徑達到2 mm左右時隨機分為6組，每組6只，分別為溶劑對照組：PBS；順鉑化療組：DDP；乳酸乳球菌疫苗組：357；乳酸乳球菌對照組：358；疫苗順鉑聯(lián)用組：357+DDP和乳酸乳球菌對照順鉑聯(lián)用組：358+DDP.小鼠體內(nèi)腫瘤直徑5～9 mm時，DDP組，357+DDP組和358+DDP組于當(dāng)天和第三天按照2.5 mg/kg的濃度腹腔注射順鉑治療；兩次化療處理中間，357組、358組、357+DDP組和358+DDP組分別通過鼻粘膜添加1.0×109/20μLPBS每只的重組乳酸乳球菌免疫治療；PBS組用等體積磷酸鹽緩沖溶液處理，兩周后重復(fù)治療.荷瘤小鼠出現(xiàn)死亡時治療終止.小鼠注射腫瘤細胞后隔天記錄體重變化，每3～4天觀察并記錄腫瘤的生長情況，當(dāng)平均腫瘤直徑>18 mm時處死小鼠.

腫瘤體積計算方法：腫瘤體積(mm)=(長徑×短徑2)／2[4].

1.2.2 ELISA檢測血清中IL-10、IL-12和IFN-γ的表達水平

首次乳酸乳球菌鼻粘膜免疫治療后第三天毛細吸管眼靜脈采血法收集小鼠血液并分離血清.血清中IL-10、IL-12和IFN-γ水平分別使用IL-10、IL-12p70和IFN-γELISA試劑盒檢測.

1.2.3 相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用(x±s)表示，統(tǒng)計學(xué)處理使用Prism軟件包分析.兩樣本均值比較采用t檢驗，生存期比較采用壽命表法，*表示P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；**表示P <0.01；***表示P <0.001.

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠體重變化趨勢

由圖1荷瘤小鼠的體重變化趨勢可知，C57BL/6小鼠注射TC-1腫瘤細胞后小鼠體重各組間未發(fā)生明顯改變.第7天首次治療后各組小鼠體重均有不同程度下降，疫苗治療357組和溶劑對照PBS和乳酸乳球菌對照358在初次治療后小鼠體重有6天輕微下降，隨后對照組體重變化不大，而疫苗治療組體重逐漸增加，至注射腫瘤細胞27天時顯著高于其他各組；DDP化療后小鼠體重均呈現(xiàn)6天連續(xù)下降，6天體重穩(wěn)定和2天升高現(xiàn)象；其中聯(lián)合治療組小鼠體重雖略低于DDP組，但組間差異不顯著.

圖1 小鼠體重趨勢圖Fig 1 Body weight trend chart of mice

2.2 乳酸乳球菌疫苗與順鉑聯(lián)用抗腫瘤效果

C57BL/6小鼠背部皮下注射1×105個TC-1細胞第7天，小鼠腫瘤直徑5～9 mm時，化療組分別在7天和第9天腹腔注射50 μg/100 μL溶于PBS的順鉑，免疫組在第8天鼻腔免疫1.0×109重組乳酸乳球菌；兩周后重復(fù)1次，每3天記錄腫瘤生長情況.腫瘤細胞注射后第29天，如圖2所示疫苗組（357：551.9±193 mm3）、化療組（DDP：218.4±108.5 mm3）及聯(lián)合治療組（357+DDP：289.9 ±242 mm3；358+DDP：199.3 ±180 mm3）小鼠腫瘤體積均顯著小于溶劑對照組（PBS：1946 ±180.7 mm3）和乳酸乳球菌對照組（358：1 128 ±230.6 mm3），且乳酸乳球菌對照組的腫瘤體積也顯著小于溶劑對照組.順鉑單獨化療組（DDP）及聯(lián)合治療組（357+DDP，358+DDP）腫瘤體積小于疫苗組357，但彼此差異并不顯著.

圖2 荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長曲線Fig 2 The inhibition effect of tumor growth in vivo

小鼠注射腫瘤29天后，如圖3所示荷瘤小鼠陸續(xù)意外死亡或因腫瘤直徑>18 mm而被安樂死，至44天時對照組PBS組和358組小鼠均因腫瘤直徑大于安樂死標準被處死.至60天時，DDP組、357組和357+DDP組存活小鼠皮下已觸及不到腫瘤，而358+DDP組小鼠皮下腫瘤在停止治療后繼續(xù)生長；至腫瘤注射85天所有小鼠皮下均未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長跡象時，DDP組和358+DDP組各有1只存活，357組有2只存活，聯(lián)合治療組357+DDP有3只存活.

圖3 荷瘤小鼠存活率Fig 3 Survival rate of tumor-bearing mice after treatment

2.3 血清中細胞因子測定

荷瘤小鼠分別于乳酸乳球菌首次滴鼻免疫后第3天通過毛細吸管眼靜脈采血法收集小鼠血并分離血清.血清經(jīng)1∶5稀釋后按博士德ELISA操作說明書檢測，結(jié)果見圖4.所有實驗組中只有357疫苗組血清中顯著檢測到IL-12與IFN-γ表達，而各組血清中抑制Th1免疫細胞和誘導(dǎo)Treg細胞發(fā)揮免疫抑制作用的IL-10表達差異并不顯著.

圖4 血清中細胞因子水平測定Fig 4 The expression level of cytokines in serum

3 討論

最近幾十年以來，放療聯(lián)合順鉑化療是晚期宮頸癌治療的金標準[2]，但晚期宮頸癌患者的五年生存率仍然很低.隨著免疫療法在眾多惡性腫瘤中取得的成功，免疫療法與放化療在局部晚期和轉(zhuǎn)移性宮頸癌中聯(lián)合作用已成為提高宮頸癌療效的新方向.前期我們證明攜帶人類乳頭狀瘤病毒16型E7蛋白和小鼠IL-12 DNA的活乳酸乳球菌疫苗鼻腔免疫后產(chǎn)生了針對HPV16 E7特定的CTL反應(yīng)，降低了腫瘤組織的生長速率，其中有25%的小鼠皮下產(chǎn)生腫瘤消退現(xiàn)象[4].這與大多數(shù)免疫療法僅對平均大小為45 mm3腫瘤治療有效一致[7]，然而未發(fā)生腫瘤組織消退的荷瘤小鼠最終還會因緩慢生長的腫瘤導(dǎo)致死亡，因此有必要聯(lián)合多種治療手段抑制腫瘤組織的快速增長，以增強腫瘤疫苗的治療效果[4].

研究顯示，順鉑等化療藥物易對患者和模型動物產(chǎn)生吞咽困難，體重減輕，肌肉萎縮，胃腸道疾病等不良影響[8]，也存在小劑量連續(xù)化療和高劑量間隔化療兩種治療方式的爭議[9,10].本研究中，357+DDP組與DDP組死亡小鼠皮下腫瘤直徑均未達到18 mm的安樂死標準，這可能與順鉑連續(xù)化療引發(fā)的意外死亡有關(guān)，也間接證實小劑量連續(xù)順鉑化療具有非腫瘤原因的死亡風(fēng)險[9].此外，抗癌分子IL-12具有促進T-helper 1 (Th1)分化和T細胞介導(dǎo)的殺傷癌細胞，抑制腫瘤血管生成的作用，但系統(tǒng)性發(fā)送IL-12治療在機體中存在顯著毒性[11].與對照358和PBS組荷瘤小鼠體重變化不大、357+DDP和358+DDP組化療期間體重持續(xù)下降不同，357組荷瘤小鼠體重受鼻粘膜免疫應(yīng)激短暫下降后，隨即與正常小鼠一樣持續(xù)增加，這與前期通過鼻粘膜途徑發(fā)送IL-12不引發(fā)顯著毒性的報道相符[4,12].然而，雖與DDP組的小鼠體重下降差異不顯著，但357+DDP組荷瘤小鼠非正常死亡時間較DDP組提前，提示鼻內(nèi)發(fā)送攜帶IL-12真核表達框的乳酸乳球菌疫苗仍可能存在較弱的毒性.令人意外的是，對照358組荷瘤小鼠皮下的腫瘤生長速度顯著低于溶劑對照PBS組，與順鉑聯(lián)用時（358+DDP組）雖然沒有改善化療引發(fā)的荷瘤小鼠體重減輕，卻顯著延長荷瘤小鼠的生存周期，這可能與乳酸乳球菌本身具有調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的能力有關(guān)[13].

本研究中乳酸乳球菌疫苗與順鉑聯(lián)合治療的腫瘤生長抑制的效果優(yōu)于疫苗單獨治療的效果，但治療組間差異并不顯著，這可能與實驗中乳酸乳球菌疫苗免疫治療的間隔過長有關(guān)[7,8]，也可能是化療與乳酸乳球菌疫苗治療間隔較近順鉑抑制免疫細胞的功能所致[5]，再者順鉑小劑量連續(xù)化療引起的非腫瘤死亡風(fēng)險也可能掩蓋了聯(lián)合治療的效果[9].然而，實驗中乳酸乳球菌疫苗與化療聯(lián)用時較高的無瘤生存率依舊顯示出該策略具有抑制腫瘤生長和消除腫瘤的潛力.因而在后期的研究中，通過增加化療與免疫的時間間隔及縮小兩次疫苗免疫的治療間隔，則有望消除目前疫苗與化療聯(lián)用時的非腫瘤死亡因素，獲得提高聯(lián)合治療策略抗腫瘤的效果.