馬立霜，李 萌

骨肉瘤是兒童群體中最常見(jiàn)的成骨性惡性腫瘤，原發(fā)于骨組織，惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較差［1］。骨肉瘤可在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移的患者5年生存率不到20%，致殘率、致死率非常之高。目前臨床需要影像學(xué)對(duì)骨肉瘤進(jìn)行輔助診斷，但多數(shù)仍需手術(shù)切除病變骨組織進(jìn)行病理證實(shí)，早期診斷手段非常局限［2］。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）［3］是白細(xì)胞的亞群，為一種特異T細(xì)胞，專(zhuān)門(mén)分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用，對(duì)某些病毒、腫瘤細(xì)胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用，與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線(xiàn)。程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD-1）是CTL細(xì)胞表達(dá)的一種免疫抑制性受體，腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)PD-1的配體程序性死亡受體配體1（programmed death receptor ligand1，PD-L1），PD-1與PD-L1結(jié)合可激活CTL胞內(nèi)抑制性信號(hào)，引發(fā)免疫抑制反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［4］?，F(xiàn)如今關(guān)于骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及生物學(xué)規(guī)律還未探明，免疫系統(tǒng)的失調(diào)可能參與骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制。大量的研究表明［5-7］，多種腫瘤組織中的PD-1和PD-L1表達(dá)與腫瘤患者分期和預(yù)后相關(guān)。筆者采用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測(cè)兒童骨肉瘤組織PD-1和PD-L1的表達(dá)，以判斷PD-1和PD-L1與患者臨床特征的關(guān)系，探討其與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月—2020年1月在筆者醫(yī)院接受手術(shù)治療的24例兒童骨肉瘤患者作為研究對(duì)象，均經(jīng)病理活檢證實(shí)患骨肉瘤，手術(shù)切除的24例骨肉瘤制作成組織標(biāo)本。14例男性患者，10例女性患者，年齡5~16歲，平均（10.5±4.3）歲。收集臨床資料并進(jìn)行出院后電話(huà)隨訪(fǎng)。個(gè)人基本資料包括年齡、性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類(lèi)型、TNM分期。隨訪(fǎng)截止日期為2019年1月。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤16歲；行骨肉瘤根治術(shù)；需經(jīng)組織病理學(xué)確診為骨肉瘤；未合并其他腫瘤；術(shù)前未進(jìn)行任何放化療及靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心腦血管疾病或其他系統(tǒng)疾病患者；合并其他嚴(yán)重腫瘤患者。該研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得所有患者及其家屬的知情同意。

1.2 樣本收集及測(cè)定兔抗人PD-1和PD-L1單克隆抗體（abl74838）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，免疫組化方法涉及的其他試劑均購(gòu)自福州邁新公司。骨肉瘤組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋組織標(biāo)本，切片、脫蠟、染色等免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟需嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：（1）骨肉瘤組織蠟塊4μm厚切片；（2）二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；（3）3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（peroxidase）的活性；（4）先進(jìn)行蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸泡5 min，并進(jìn)行2次；（5）pH8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）0.5 mol/L進(jìn)行微波抗原修復(fù)10 min；（6）使用5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1 h；（7）PBS沖洗，5 min，并進(jìn)行3次；（8）滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30 min；（9）PBS沖洗，5 min，并進(jìn)行3次；（10）滴加適量堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SABC）工作液，37℃孵育30 min；（11）PBS沖 洗，5 min，并進(jìn)行3次；（12）免疫組化染色DAB室溫顯色3 min；（13）使用蒸餾水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

PD-L1、PD-1陽(yáng)性物為棕黃色顆粒，均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。在光鏡下（×400）10個(gè)視野計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。根據(jù)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比（A）和染色強(qiáng)度（B）兩個(gè)方面進(jìn)行分析：（1）陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比（A）：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞百分比26%~50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞百分比51%~75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥76%；（2）染色強(qiáng)度（B）：0分為無(wú)染色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。AB相乘結(jié)果≥1表示結(jié)果為陽(yáng)性。

分析PD-1和PD-L1與患者性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類(lèi)型、TNM分期數(shù)的相關(guān)性。TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）TNM分期系統(tǒng)。

通過(guò)電話(huà)、復(fù)查方式得到患者無(wú)疾病生存期（disease-free survival，DFS）即從確診骨肉瘤至腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移或最后一次隨訪(fǎng)的時(shí)間。隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2020年1月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；PD-1和PD-L1與患者年齡、性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類(lèi)型、TNM分期的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)；使用Kaplan-Meier方法對(duì)骨肉瘤患者無(wú)疾病生存期進(jìn)行生存分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1和PD-L1表達(dá)與骨肉瘤患者臨床特征的相關(guān)性表1顯示：PD-1和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)與患者年齡、性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類(lèi)型、TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。PD-1在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上低表達(dá)，PD-L1在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上高表達(dá)；見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 、2見(jiàn)封三。

圖1 PD-1免疫組化圖片（×400）

圖2 PD-L1免疫組化圖片（×400）

表1 PD-1和PD-L1表達(dá)與骨肉瘤患者臨床特征的相關(guān)性［例（%）］

2.2 骨肉瘤組織中PD-1/PD-L1與患者無(wú)疾病生存期的關(guān)系通過(guò)Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析24個(gè)月無(wú)疾病生存期，PD-1陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)的無(wú)疾病生存期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.618）；PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)的無(wú)疾病生存期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 、4見(jiàn)封三。

圖3 兒童骨肉瘤患者PD-1陽(yáng)/陰性表達(dá)的24個(gè)月生存曲線(xiàn)

圖4 兒童骨肉瘤患者PD-L1陽(yáng)/陰性表達(dá)的24個(gè)月生存曲線(xiàn)

3 討論

骨肉瘤是一種侵襲性強(qiáng)、患者預(yù)后差的原發(fā)性惡性腫瘤［8］，可發(fā)病于各個(gè)年齡段，但最常見(jiàn)于兒童，是威脅我國(guó)兒童健康的主要惡性腫瘤之一。骨肉瘤與其他惡性腫瘤一樣，在初期具有隱匿性，典型的臨床癥狀和體征（壓痛疼痛、關(guān)節(jié)腫脹、有腫塊、活動(dòng)受限等）在疾病早期發(fā)現(xiàn)比較困難，患者就診時(shí)大多已到中晚期。骨肉瘤外科手術(shù)治療預(yù)后差，并且對(duì)患者的生活質(zhì)量造成較大的影響。新輔助化療方案即術(shù)前化療+外科手術(shù)+術(shù)后化療［9］，這種方案使得骨肉瘤患者預(yù)后得到較大改善。該研究探討骨肉瘤分子水平發(fā)病機(jī)制，對(duì)骨肉瘤的早期診斷和治療具有重要意義。

該研究提示，PD-1和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類(lèi)型、TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），與藍(lán)瑞隆等［9］的研究結(jié)果一致。但在骨外骨肉瘤、鼻咽癌［4］、結(jié)直腸癌［10］組織的PD-1和PD-L1的表達(dá)研究中，發(fā)現(xiàn)PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期有關(guān)。而該研究結(jié)果可能與所納入的樣本量有較大的關(guān)系，需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與患者的無(wú)疾病生存期（DFS）有關(guān)，PD-1陽(yáng)性表達(dá)與患者的DFS無(wú)明顯相關(guān)性，可能是因?yàn)楣侨饬黾?xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下高表達(dá)PD-L1，PD-L1的高表達(dá)可誘導(dǎo)骨肉瘤患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的凋亡并增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力而導(dǎo)致病死率上升［11］，形成惡性循環(huán)，改變骨肉瘤細(xì)胞的微環(huán)境，由此推測(cè)PD-L1可以作為患者預(yù)后的標(biāo)志。

綜上所述，PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)與兒童骨肉瘤患者的DFS有關(guān)，可作為判斷患者預(yù)后的標(biāo)志。另外對(duì)PD-1/PD-L1通路的研究，可為骨肉瘤病理診斷和臨床治療提供參考，為靶腫瘤精準(zhǔn)化治療提供有力保障［12］。通過(guò)個(gè)體化應(yīng)用PD-1/PD-L1免疫抑制劑，并且調(diào)整免疫抑制劑劑量，修飾并矯正宿主免疫反應(yīng)，直接靶向腫瘤細(xì)胞對(duì)于骨肉瘤患者治療更為高效。