基于3,5-二硝基水楊酸比色法探究蘋果中可溶性糖測定方法及其含量*

高貫威，匡立學(xué)，李銀萍，李 靜，李海飛，徐國鋒

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（興城），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗 測試中心（興城），遼寧興城125100）

可溶性糖是衡量水果及其制品風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)[1-2]。果品中可溶性糖以葡萄糖、果糖和蔗糖為主[3-5]，但其構(gòu)成在不同水果中存在差異。根據(jù)主要可溶性糖的種類不同，水果可分為果糖積累型和蔗糖積累型[6]。蘋果是我國第一大水果，其產(chǎn)量和消費量均居我國園林水果首位[7-8]。蘋果中可溶性糖是其甜度和風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵因素[9]，且以果糖為主，其次是蔗糖和葡萄糖[10]。蘋果中可溶性糖組分和含量的研究已有報道[11-13]。然而，其組分間定量關(guān)系的探討比較欠缺。另外，研究表明，蘋果中可溶性糖含量與其可溶性固形物含量之間呈極顯著正相關(guān)[10]。二者均是決定水果風(fēng)味的關(guān)鍵性因素[6]，是水果品質(zhì)的重要監(jiān)測指標(biāo)。

《水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法》[14]（以下簡稱3,5-二硝基水楊酸比色法）在水果可溶性糖檢測工作中的應(yīng)用非常廣泛。此方法測定原理是將可溶性非還原糖進(jìn)行酸化，并轉(zhuǎn)化為還原糖，堿性條件下與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成棕紅色的氨基化合物，該氨基化合物在540 nm 波長下有特定吸光值。然而，3,5-二硝基水楊酸比色法中存在一定的不確定表述，易造成人們對測定結(jié)果產(chǎn)生異議。比如，水浴加熱后的試樣是否冷卻再加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，方法中并未指明。另外，為保證反應(yīng)的堿性條件，試樣中逐步加入氫氧化鈉（NaOH）溶液至溶液呈“淺橙色”（甲基紅試劑）。然而，淺橙色的判斷易因人而異。

本研究探究了3,5-二硝基水楊酸比色法中不確定因素在可變范圍內(nèi)對可溶性糖檢測結(jié)果的影響，降低了蘋果中可溶性糖測定結(jié)果的異議。另外，本研究采用優(yōu)化后的方法測定了100 個蘋果樣品中可溶性糖含量，并根據(jù)NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》（以下簡稱NY/T 2637—2014）[15]測定了其可溶性固形物含量，為蘋果中可溶性糖和可溶性固形物含量分析提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

蘋果樣品均來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（興城）。

1.2 可溶性糖和可溶性固形物含量的測定

可溶性糖含量按照NY/T 2742—2015 標(biāo)準(zhǔn)中的步驟測定，可溶性固形物含量采用 PR-101α 數(shù)顯式全糖儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸鋅和亞鐵氰化鉀

樣品經(jīng)過水浴加熱后，為避免樣品中的蛋白質(zhì)影響糖的測定，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，將蛋白質(zhì)沉淀。然而，樣品是否需要冷卻，3,5-二硝基水楊酸比色法未進(jìn)行準(zhǔn)確表述。為驗證亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液加入時間，將相同蘋果樣品水浴加熱，并在冷卻前后的樣品中均加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，而后按照相同步驟測定其可溶性糖含量（n＝3）。測定結(jié)果表明，冷卻前后樣品中可溶性糖含量平均值分別為15.0%、14.5%，前者略高于后者。然而，二者相對偏差為3.1%，遠(yuǎn)低于NY/T 2742—2015標(biāo)準(zhǔn)中重復(fù)性條件下2 次獨立測試結(jié)果限定的標(biāo)準(zhǔn)偏差（10%），表明亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液加入時，樣品是否冷卻對蘋果中可溶性糖含量測定值影響不大。

2.2 顏色調(diào)節(jié)

還原糖與3,5-二硝基水楊酸的反應(yīng)需要堿性條件，因此樣品溶液中需要加入NaOH 溶液，并以甲基紅指示劑判定樣品酸堿度。3,5-二硝基水楊酸比色法中指出樣品溶液調(diào)節(jié)至“淺橙色”時即可滿足檢測需求。然而，溶液顏色肉眼判斷因人而異。

將相同樣品逐步提高NaOH 溶液的加入體積，分別調(diào)節(jié)至肉眼易判斷的淺紅色、橙黃色和淺黃色，并按照相同步驟測定樣品吸光度值（n＝5）。結(jié)果如表1 所示，樣液呈現(xiàn)淺紅色、橙黃色和淺黃色時，其吸光度值分別為0.757～0.816、0.793～0.849 和0.779～0.838。經(jīng)SPSS 數(shù)據(jù)分析，顏色調(diào)節(jié)為淺紅色時，樣品吸光度值平均值為0.788（n＝5），顯著低于橙黃色樣品吸光度值（0.817）。同時，橙黃色和淺黃色樣品吸光度值之間無顯著差異（P＜0.05）。表明甲基紅指示劑指示下，需要將樣品采用NaOH 溶液調(diào)節(jié)至無明顯紅色，橙黃色或者淺黃色時（NaOH 溶液稍過量）樣品中可溶性糖檢測結(jié)果無顯著差別。

表1 調(diào)節(jié)至不同顏色時相同樣品最終吸光度值比較

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是樣品中目標(biāo)物含量測定的衡量基準(zhǔn)，是測定結(jié)果準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵。3,5-二硝基水楊酸比色法中采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并規(guī)定葡萄糖需要干燥處理。在實際操作中，干燥環(huán)節(jié)常常被忽略。本研究將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在80 ℃下干燥2 h，并將干燥前后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成1 mg/mL 的水溶液，繼而分別配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照NY/T 2742—2015 中的步驟使其與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)，并分別測定吸光度值。

如圖1 所示，干燥前后標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值與濃度線性關(guān)系良好，R2均大于0.99。烘干后標(biāo)準(zhǔn)品最終吸光度值明顯高于烘干前標(biāo)準(zhǔn)品，表明長時間儲存的標(biāo)準(zhǔn)品中可能含有一定量的水分，造成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度不足，吸光度值相對較低。經(jīng)計算，同一個蘋果樣品分別經(jīng)干燥前后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度值-濃度線性曲線計算，可溶性糖測定值前者高于后者12%（以干燥后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為基準(zhǔn)）。因此，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的干燥對測定果品中可溶性糖含量至關(guān)重要。

圖1 烘干前后葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值線性曲線

2.4 碳酸鈣（CaCO3）

已廢標(biāo)準(zhǔn)GB 6194—1986[16]標(biāo)注，有機酸含量比較高的樣品中應(yīng)加入0.5～2.0 g CaCO3調(diào)節(jié)樣品溶液至中性，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2742—2015 并未標(biāo)注CaCO3是否加入。因此，實際操作中，檢測人員對CaCO3是否需要加入呈疑惑狀態(tài)。本研究將10 g 已勻漿蘋果樣品（n＝6）稱量至燒杯中后，加入CaCO3約1.5 g。另外，相同樣品未加入CaCO3，按照3,5-二硝基水楊酸比色法測定樣品的吸光度值。

結(jié)果表明，加入和未加CaCO3的樣品最終吸光度值（n＝6）平均分別為0.977、0.982，經(jīng)過SPSS分析，二者吸光度值無顯著差異（P＜0.05）。然而，如圖2 所示，當(dāng)加入CaCO3時樣品吸光度值為0.894～1.037，吸光度值波動范圍較大。同時，未加入CaCO3的樣品吸光度值比較穩(wěn)定（0.975～0.995）。因此，本研究結(jié)果表明蘋果可溶性糖測定時無需加入CaCO3。

圖2 CaCO3 對蘋果樣品可溶性糖測定最終吸光度值的影響

2.5 蘋果可溶性固形物和可溶性糖含量測定

根據(jù)驗證后的方法，測定了100 個蘋果樣品中可溶性糖含量，并根據(jù)NY/T 2637—2014[15]測定其可溶性固形物含量。結(jié)果表明，蘋果中可溶性糖和可溶性固形物含量分別為8.9%～15.0%、11.5%～18.4%（圖3），與前人研究結(jié)果相近[10,17]。蘋果樣品中可溶性糖含量在可溶性固形物含量中的比重（糖固比）平均為77.8%，且二者呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.783，與前人研究結(jié)果（0.735）相近[17]。水果中可溶性固形物含量采用PR-101α 數(shù)顯式全糖儀測定，操作簡單、數(shù)值穩(wěn)定。因此，可溶性糖含量測定值出現(xiàn)異常時，可參考相應(yīng)樣品中可溶性固形物含量測定值進(jìn)行判定。

圖3 蘋果樣品中可溶性糖及可溶性固形物含量（n＝100）

3 結(jié)論與討論

本研究探究了3,5-二硝基水楊酸比色法中不確定表述，并分析了其在可變范圍內(nèi)對可溶性糖檢測結(jié)果的影響。對比樣品冷卻前后加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，二者可溶性糖測定值相對偏差為3.1%，遠(yuǎn)低于NY/T 2742—2015 標(biāo)準(zhǔn)限定的標(biāo)準(zhǔn)偏差（10%），表明樣品冷卻前后均可加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液。

采用NaOH 溶液調(diào)節(jié)樣品顏色至淺紅色時，樣品吸光度值平均為0.788（n＝5），顯著低于橙黃色樣品（0.817），NaOH 溶液加入量較多的橙黃色和淺黃色樣品吸光度值之間無顯著差異（P＜0.05），表明測定蘋果樣品中可溶性糖時，甲基紅指示劑指示下，需要將樣品調(diào)節(jié)至無明顯紅色，NaOH 溶液稍過量對樣品中可溶性糖檢測結(jié)果影響較小。

未烘干葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品中可能含有一定量的水分，造成純度不足，吸光度較低。本文中，樣品經(jīng)干燥前標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度-吸光度值線性曲線計算，可溶性糖測定值偏高12%（以干燥后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為基準(zhǔn)）。因此，可溶性糖測定過程中務(wù)必定期將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行干燥處理。

CaCO3是否加入對蘋果樣品中可溶性糖測定結(jié)果影響不大，而且加入CaCO3時平行樣品之間吸光度值相差較大，因此可溶性糖測定過程中無需加入CaCO3。

蘋果中可溶性糖主要為果糖，其次為蔗糖和葡萄糖[10]。3,5-二硝基水楊酸比色法中，以葡萄糖（還原性糖）為標(biāo)準(zhǔn)品，并將樣品中的蔗糖酸化分解成為果糖（還原性糖）和葡萄糖。相近，已廢標(biāo)準(zhǔn)GB 6194—1986[16]中將標(biāo)準(zhǔn)品蔗糖進(jìn)行酸化，使其轉(zhuǎn)化成還原性糖（果糖和葡萄糖），同時將樣品中蔗糖轉(zhuǎn)化為還原糖，依此測定水果、蔬菜中可溶性糖含量。然而，樣品中和水溶液中蔗糖轉(zhuǎn)化效率可能存在差異，果糖與葡萄糖還原效率也可能不同。水果中可溶性糖組成存在差異，多數(shù)果品以葡萄糖、果糖和蔗糖中的某一種為主[6]。因此，將葡萄糖、果糖和蔗糖在檢測儀器中分別進(jìn)行測定可能是可溶性糖含量更為準(zhǔn)確的測定方法。