張金青，賈新鳳，李凡，李玉珠，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

草地早熟禾(Poapratensis)主要分布在寒帶和北溫帶冷涼濕潤地區(qū)，是草原與草甸植被組成中的重要成分[1]，其不僅是很多天然草地中的優(yōu)良牧草，同時也被廣泛應(yīng)用于草坪建植[2]。此外，它還可用于穩(wěn)定侵蝕土壤、改善土壤結(jié)構(gòu)和肥力[3]。由于草地早熟禾品種選育工作滯后，我國草坪建植中所用的草地早熟禾種子全是國外引進(jìn)品種，因此培育我國的優(yōu)良草地早熟禾新品種極其重要，這有賴于對我國草地早熟禾野生種或生態(tài)型的搜集。同時Wieners等[3]也指出若要改善草地早熟禾，如減少其在生產(chǎn)上的管理投入、提高其抗病蟲性、耐低修剪或其他重要農(nóng)藝性狀，則需要收集和鑒定不同的種質(zhì)。甘肅地處青藏高原、黃土高原、蒙新高原和西秦嶺山地的交匯地帶，境內(nèi)地形、氣候復(fù)雜多樣，早熟禾屬植物資源十分豐富，這為搜集不同的草地早熟禾野生種質(zhì)材料提供了便利[5]。近幾年，甘肅野生草地早熟禾的研究主要集中在抗旱性[6]、抗寒性[7]、耐踐踏性[8]、根莖擴(kuò)展性[9]以及生產(chǎn)性能[10]等方面，而有關(guān)其多胚苗的研究較少。

草地早熟禾具有多樣的生殖系統(tǒng)，主要是無孢子生殖和有性雜交或自交的兼性無融合生殖體系[11]。無融合生殖具有雙胚珠、雙胚囊、雙胚雙苗或多苗等特點，這種由一粒多胚種子同時萌發(fā)出兩株或兩株以上的幼苗稱為多胚苗[12]。母錫金等[13]和田晨霞等[14]的研究均表明草地早熟禾產(chǎn)生雙胚苗和三胚苗是常見的。已有研究表明，植物中多胚與其無融合生殖之間具有正相關(guān)性，因而許多學(xué)者試圖通過尋找具有多胚現(xiàn)象的植物材料，進(jìn)而篩選出一些可能具有無融合生殖特性的種質(zhì)資源。植物多胚現(xiàn)象的發(fā)生涉及多胚的形成和表現(xiàn)兩大階段，前者主要由遺傳背景控制，而后者則受到外界條件的影響[14]，例如黃宇[16]研究發(fā)現(xiàn)閩楠(Phoebebournei)種子在不同貯藏時間和培養(yǎng)條件下發(fā)芽率和多胚率都有所不同；黃群策等[17]也發(fā)現(xiàn)水稻(Oryzasativa)多胚苗發(fā)生頻率因材料種類或發(fā)芽溫度不同而表現(xiàn)出差異，此外也報道了種子去稃殼后可使其雙苗率提高32.4%～36.0%。同時，黃雪梅等[18]也發(fā)現(xiàn)黃花風(fēng)鈴木(Tabebuiachrysantha)種子貯藏溫度從15℃降為10℃時，其多胚率也由63.3%降為50.0%；王巨媛[19]通過對38個韭菜(Alliumtuberosum)的多胚苗研究，指出其多胚苗發(fā)生頻率與溫度之間存在“低溫效應(yīng)”，即溫度越低多胚苗發(fā)生頻率越高?？梢姡蛔又参锓N子的萌發(fā)環(huán)境和萌發(fā)狀態(tài)對其多胚苗頻率具有顯著影響，但這些外界條件對草地早熟禾的多胚苗頻率是否有影響，其影響規(guī)律如何依然不清楚。因此，本研究以采集于甘肅不同地區(qū)的7個野生草地早熟禾種質(zhì)為材料，探索不同萌發(fā)溫度和種子萌發(fā)時的不同狀態(tài)(除稃殼)下草地早熟禾多胚苗頻率的變化規(guī)律，以期為揭示草地早熟禾無融合生殖機(jī)理，選育我國本土的優(yōu)良草地早熟禾新品種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為2012年8-9月采集于甘肅隴南市、甘南州夏河縣、張掖市肅南縣、定西市、天水市甘谷縣、清水縣、秦州區(qū)7個地區(qū)的野生草地早熟禾，種子經(jīng)人工清選、自然干燥后，長期于25℃保存。用采集地的地名分別表示該地采集的野生草地早熟禾種質(zhì)材料。

1.2 試驗方法

試驗前，對種子進(jìn)行消毒處理，具體步驟為先用自來水浸泡12 h，然后用70%乙醇消毒2 min，再用20%次氯酸鈉浸泡15 min，最后用無菌水沖洗5～6次，直到去除次氯酸鈉的刺鼻味，晾干待用。

供試材料每種取8 000粒晾干后的飽滿種子，其中4 000粒置于體式顯微鏡下剝除稃殼，然后帶稃殼種子和除稃殼種子各取1 000粒為1組，每種4組，根據(jù)《牧草種子檢驗規(guī)程—發(fā)芽試驗》[20]進(jìn)行發(fā)芽試驗，4組種子對應(yīng)的萌發(fā)溫度分別為15℃、20℃、25℃和30℃。其他條件均相同，即在每個鋪有2層濾紙的9 cm塑料培養(yǎng)皿中放置100粒種子，分別加入4 mL無菌水，每處理10個重復(fù)。培養(yǎng)條件為光照14 h、黑暗10 h，每天采用稱重補(bǔ)水法補(bǔ)充蒸發(fā)的無菌水，25 d后結(jié)束試驗，統(tǒng)計并記錄各培養(yǎng)皿的發(fā)芽種子和雙胚苗和三胚苗及多胚苗的數(shù)量，然后計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率和雙胚苗、三胚苗及多胚苗的頻率。計算方法參考田晨霞等[14]的方法：

發(fā)芽勢(%)=第13 d 發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率(%)=第25 d 發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

雙胚苗率(%)=雙胚苗數(shù)量/第25 d 發(fā)芽種子數(shù)×100%

三胚苗率(%)=三胚苗數(shù)量/第25 d 發(fā)芽種子數(shù)×100%

多苗率(%)=(雙胚苗數(shù)量+三胚苗數(shù)量)/第25 d 發(fā)芽種子數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

運用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan法比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾發(fā)芽特性的影響

2.1.1 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾發(fā)芽勢的影響 在萌發(fā)溫度和種子狀態(tài)不同時，7個地區(qū)采集的種子發(fā)芽勢不同。相較于帶稃殼，除稃殼后隴南種子的發(fā)芽勢在相同溫度下均顯著降低，且不管稃殼是否存在，均在15℃時顯著低于其余溫度，其他溫度間沒有差異。甘南種子的發(fā)芽勢在除稃殼后均高于帶稃殼，僅15℃差異不顯著；溫度對其發(fā)芽勢的影響因種子的狀態(tài)而異，帶稃殼時，隨著溫度的上升而逐漸升高，除稃殼后，在25℃時達(dá)到最大值，30℃時顯著降低。清水種子的發(fā)芽勢變化較單一，15℃時顯著低于其余溫度，是否除稃殼的區(qū)別在于：除稃殼后，其發(fā)芽勢在相同溫度下略有升高。除稃殼后，相同溫度下肅南種子的發(fā)芽勢均顯著高于帶稃殼，且同一種子狀態(tài)時其隨著溫度的變化趨勢相同，均表現(xiàn)為隨著溫度升高而逐漸上升，25℃達(dá)到最大值，且與30℃無顯著差異。無論是否帶稃殼，定西種子的發(fā)芽勢均在15℃時顯著低于其他溫度，其余溫度間無顯著差異，稃殼的影響較小，除15℃時除稃殼顯著高于帶稃殼外，其余溫度下無顯著差異。秦州種子發(fā)芽勢隨溫度與稃殼的變化與清水相同，即除稃殼后略有升高；且不管有無稃殼，均在15℃時顯著低于其他溫度，且其余溫度間無顯著差異。稃殼的有無對甘谷種子發(fā)芽勢的影響為：除15℃差異不顯著外，其余溫度下除稃殼均顯著高于帶稃殼；帶稃殼時，30℃顯著高于15℃，其余溫度間無顯著差異，除稃殼后，30℃顯著高于20℃和15℃，與25℃差異不顯著(表1)。

表1 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾發(fā)芽勢的影響

2.1.2 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾發(fā)芽率的影響 不同溫度與是否除稃殼對不同的野生草地早熟禾種質(zhì)材料的發(fā)芽率影響不同，其中秦州種子的表現(xiàn)較特別，所有的處理間均無顯著差異(表2)，當(dāng)溫度從15℃升高到30℃時，帶稃殼種子發(fā)芽率變化幅度最大，降低了2.54%；除稃殼后，發(fā)芽率在25℃變化最大，升高了0.57%。此外，肅南的變化也不同于其余材料，不管是否除去稃殼，其發(fā)芽率均在25℃時最高，不同的是帶稃殼時25℃與其他溫度間均差異顯著，除稃殼時25℃與20℃間無顯著差異，但顯著高于15℃和30℃；稃殼對肅南發(fā)芽率的影響與溫度有關(guān)，僅20℃時除稃殼顯著高于帶稃殼，其他溫度下無顯著差異。其他材料在種子狀態(tài)相同時，其發(fā)芽率均隨著萌發(fā)溫度的升高而逐漸降低，不同的材料間其降低程度存在差異，當(dāng)溫度從15℃升高到30℃時，隴南在除稃殼后降低程度最大，為25.44%。比較稃殼對其余野生草地早熟禾發(fā)芽率的影響，發(fā)現(xiàn)清水和甘谷在溫度不變時，其發(fā)芽率均在除去稃殼后升高，不同材料升高程度不同；但是隴南的表現(xiàn)正好相反：在溫度保持不變時，其發(fā)芽率在除稃殼后顯著下降，最高可下降30.17%，推測其原因可能是隴南種子的稃殼對種子的包裹比較緊密，在去除稃殼時對種子造成了一定的傷害，進(jìn)而降低了其發(fā)芽率。

表2 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾發(fā)芽率的影響

2.2 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾多胚苗頻率的影響

2.2.1 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾二胚率的影響 不同萌發(fā)溫度下以及種子除去稃殼后隴南和甘谷采集的種子所有處理間均無顯著差異，這表明它們的二胚率不受外界條件溫度以及種子狀態(tài)的影響(表2)。甘南種子的二胚率變化最明顯，帶稃殼時，4個溫度下其二胚率均為0，除稃殼后，其二胚率隨著溫度的升高而增大。清水種子的二胚率隨著溫度的升高先上升再降低，帶稃殼種子在20℃發(fā)芽率達(dá)到最大，且與其余溫度相比差異顯著，除稃殼時25℃略高于其他溫度，但與其余溫度相比均無顯著差異。肅南種子的二胚率在種子狀態(tài)不同時，隨溫度的變化不同：帶稃殼時隨溫度升高而升高，但各溫度之間差異均不顯著；除稃殼時隨溫度升高先升高再降低，在25℃達(dá)到最大，但與其余溫度相比均無顯著差異。定西種子二胚率的變化比較規(guī)律，首先隨著溫度的升高而增大，且在30℃時顯著高于其他溫度，其余溫度間差異不顯著；其次溫度不變時，相較于帶稃殼，其二胚率在除稃殼后均略有升高，但差異不顯著。秦州種子的二胚率隨著溫度的升高先升高再降低，在20℃達(dá)到最大值，稃殼的影響在于帶稃殼時，最大值與其余溫度間均具有顯著差異，除稃殼后，最大值與其余溫度間均無顯著差異，且在溫度相同時，除稃殼后其二胚率均顯著高于帶稃殼。

表3 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾二胚率的影響

2.2.2 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾三胚率的影響 甘肅野生草地早熟禾在不同溫度以及除稃殼處理后，各材料的三胚率變化不明顯(表4)，這可能是由于草地早熟禾的三胚苗頻率偏低，導(dǎo)致在不同條件時變化不明顯。在所有材料中，定西種子的三胚率在任何溫度以及除稃殼后均為0，推測定西可能并不具有三胚苗的特性。甘南和清水地區(qū)采集種子的三胚率變化比較一致，相較于溫度的變化，其對于是否除稃殼的變化更敏感，在帶稃殼時，三胚率均為0，除稃殼后，不同溫度下均有三胚苗的萌發(fā)，但各溫度下差異不顯著；二者所不同的是，甘南種子的三胚率除稃殼后與帶稃殼時相比無顯著差異，而清水種子除稃殼后顯著高于帶稃殼。隴南、肅南和秦州地區(qū)采集種子的三胚率在所有處理下均無差異，表明這三個材料的三胚率不受溫度和稃殼的影響。在帶稃殼20℃和30℃時天水種子的三胚率顯著高于其他處理，其余處理下不受溫度和稃殼的影響。

2.2.3 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾多胚率的影響 隴南和甘谷種子的多胚率變化一致，在所有處理下均無差異，表明它們的多胚率不受萌發(fā)溫度和種子稃殼的影響(表5)。甘南種子的多胚率在帶稃殼時，不受溫度的影響，各溫度下均為0；除稃殼后，其多胚率隨著溫度的升高而逐漸增大。清水多胚率隨著溫度的升高先上升再降低，稃殼存在與否的差異在于前者在20℃達(dá)到最大值，與其余溫度間有差異，但不顯著，除稃殼后20℃和25℃間無顯著差異，且均高于15℃和30℃。肅南的多胚率在除稃殼25℃時達(dá)到最大值，顯著高于帶稃殼15℃，與其余溫度有差異但不顯著。定西由于其三胚率均為0，故其多胚率的變化與二胚率相同，均表現(xiàn)為隨著溫度的升高而增大，且在30℃時顯著高于其他溫度，其余溫度間差異不顯著；溫度不變時，相較于帶稃殼，定西的多胚率在除稃殼后均略有升高，差異不顯著。秦州的多胚率隨著溫度的升高先升高再降低，20℃時達(dá)到最大值，且?guī)э麣r顯著高于其余溫度。

表5 溫度和稃殼對甘肅野生草地早熟禾多胚率的影響

3 討論

3.1 溫度及稃殼對草地早熟禾發(fā)芽特性的影響

3.1.1 溫度對草地早熟禾發(fā)芽特性的影響 溫度影響種子發(fā)芽是通過影響其代謝反應(yīng)來實現(xiàn)的[22]，當(dāng)環(huán)境溫度過高或過低時，會導(dǎo)致細(xì)胞中的酶失活，致使細(xì)胞不能進(jìn)行正常的生理代謝而死亡[23]。發(fā)芽勢和發(fā)芽率可反映種子發(fā)芽的速度和整齊度，一般來說，發(fā)芽率高、發(fā)芽勢強(qiáng)，表示出苗快而齊，苗壯，反之則表示出苗不齊、弱苗多。本研究發(fā)現(xiàn)，不管是否除稃殼，甘肅野生草地早熟禾的發(fā)芽勢均隨著溫度的升高而上升。發(fā)芽率的變化在除稃殼后以及不同的材料之間均不相同，除肅南種子外，總體趨勢為隨著溫度的上升而下降。筆者前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度升高到35℃時，草地早熟禾材料均不發(fā)芽，這表明草地早熟禾作為冷季型草坪草，對低溫耐性較強(qiáng)，而對高溫則比較敏感。然而，溫度較低時，雖然其發(fā)芽率較高，但發(fā)芽勢過低，存在出苗不齊、弱苗多的現(xiàn)象。此外，不同材料發(fā)芽狀況受溫度的影響并不相同，這可能與種子原產(chǎn)地的氣候條件有關(guān)，因此在實際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)具體的草地早熟禾材料篩選其適宜的發(fā)芽溫度。

3.1.2 稃殼對草地早熟禾發(fā)芽特性的影響 稃殼是指禾本科植物小穗基部的苞片，具有保護(hù)稃果的作用[25]。然而，有些稃殼厚而堅硬，使種子不透水、不透氣或?qū)ε呔哂袡C(jī)械阻礙作用，而抑制種子萌發(fā)[25]。稃殼對不同植物發(fā)芽率的影響差異較大，黃群策[17]報道，水稻種子去殼可使其發(fā)芽率提高3%左右；趙昕等[27]研究發(fā)現(xiàn)，除稃殼后結(jié)縷草(Zoysiajaponica)種子發(fā)芽率明顯高于對照；王禹等[28]發(fā)現(xiàn)湘雜芒2號(Miscanthussinensis×lutarioripari)種子除稃殼后，發(fā)芽率由66%提高到86%。也有相關(guān)研究報道除稃殼降低了種子發(fā)芽率，如譚志軍等[26]的研究；任萬軍等[29]也報道去除稃殼處理可使水稻種子的成苗率降低26.1%，且不同雜交稻組合間差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的草地早熟禾在除稃殼后，發(fā)芽率的變化不同。這表明稃殼對種子發(fā)芽的影響因植物品種和來源而異。推測除稃殼處理促進(jìn)發(fā)芽率的原因可能是去殼消除了稃殼上的不透氣性、不透水性和稃殼的機(jī)械約束作用[25]，也可能是稃殼中具有發(fā)芽抑制物，去除稃殼意味著發(fā)芽抑制物的消除，因而提高了發(fā)芽率。降低種子發(fā)芽率可能是種子在除稃過程中，傷害了稃果的果皮和種皮，導(dǎo)致營養(yǎng)外滲，進(jìn)而引起污染[26]。因此，稃殼對發(fā)芽的影響可能是多個因素平衡后的表現(xiàn)，故是否能用除稃殼的方式提高植物的發(fā)芽率，則需要根據(jù)具體的材料做相關(guān)的試驗后才能應(yīng)用于實踐。

3.2 溫度及稃殼對草地早熟禾多胚苗頻率的影響

3.2.1 溫度對草地早熟禾多胚苗頻率的影響 植物多胚現(xiàn)象的發(fā)生涉及多胚的形成和表現(xiàn)兩大階段，前者受到遺傳背景的控制，其表現(xiàn)又受到外界條件的影響，故其發(fā)生頻率受環(huán)境因素如溫度的影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)草地早熟禾的多胚苗率因材料種類或萌發(fā)溫度不同而表現(xiàn)出差異，這與前人的研究結(jié)果相似[16]。此外，隴南、甘南和甘谷種子的多胚率不隨溫度改變，這表明不同的材料多胚率對溫度的敏感性及反應(yīng)度都不同。譚志軍等[26]認(rèn)為植物多胚率是由基因型所決定的，而基因表達(dá)受外界環(huán)境的影響，故適宜的萌發(fā)溫度是植物多胚充分表達(dá)的因素之一。這可能是不同溫度時，草地早熟禾多胚苗頻率不同的原因。前人研究報道適當(dāng)?shù)母邷靥幚碛欣谒径嗯呙珙l率的提高，因為適宜的高溫可提高種子胚乳貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率，利于多胚的萌發(fā)[26]。然而，本試驗結(jié)果不同于該報道，僅定西種子在30℃時多胚率最高，而清水和秦州種子在20℃時，其多胚率高于其他溫度，這可能是由于研究材料不同而造成的差異，也可能與實驗中所設(shè)置的具體溫度范圍有關(guān)。

3.2.2 稃殼對草地早熟禾多胚苗頻率的影響 種子稃殼的有無影響植物的多胚苗頻率，如黃群策[17]等報道，在ASDOR05-01和ASDOR05-02水稻群體內(nèi)，種子去稃殼后使其雙苗頻率分別提高了32.4%和36.0%。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的材料除稃殼后，多胚率變化不同，除極個別外，大多數(shù)材料在同一溫度下除稃殼后，多胚苗頻率會有所升高。這可能是由于合子胚是有性生殖，具有較強(qiáng)的生長優(yōu)勢，且都較靠近稃殼上唯一的萌發(fā)孔，故容易萌發(fā)。然而，另一個胚是無性生殖胚，與有性胚相比其生長狀態(tài)處于劣勢，且一般都遠(yuǎn)離萌發(fā)孔，故稃殼對其萌發(fā)具有明顯的阻礙作用，因此，稃殼的存在直接影響了多胚的發(fā)生[30]。

3.3 提高草地早熟禾多胚苗頻率的措施

草地早熟禾不僅是草坪草，還可以作為牧草利用，多胚苗的萌發(fā)及成苗會增加其地上生物量，增大裸地的覆蓋率，提高種子的產(chǎn)量。此外，康慶華[31]認(rèn)為多胚苗可作為篩選無融合生殖種質(zhì)的標(biāo)志性狀，可以將具有雙胚性的材料作為誘導(dǎo)無融合生殖后代的遺傳基礎(chǔ)，同時多胚現(xiàn)象在胚胎發(fā)育研究、雜種優(yōu)勢固定、單倍體育種及自交系選育等方面均有重要價值[32]。因此，提高多胚苗頻率在實際生產(chǎn)中具有重要意義。研究報道，對于具有潛在能力的多胚種子，萌發(fā)條件對多胚苗的表達(dá)起決定性作用，故優(yōu)化萌發(fā)條件對于多胚苗的獲得極為重要。因此，可通過控制種子萌發(fā)條件提高其多胚率，如種子去殼、預(yù)處理溫度、Zn2+或H2O2處理、Co60-Y射線輻射、萌發(fā)溫度以及外源激素(IAA、KT、GA3、2,4-D、6-BA)處理[33]。另外，馮輝等[34]也研究報道，用0.6%二甲基亞砜(DMSO)或失活花粉處理韭菜，其多胚苗發(fā)生頻率明顯提高。

本研究結(jié)果表明，草地早熟禾主要有單胚苗、二胚苗和三胚苗3種種苗，其頻率大小為單胚苗>二胚苗>三胚苗，且不同野生材料的多胚頻率存在差異，萌發(fā)溫度和去除稃殼對其影響也不同，這表明草地早熟禾的多胚現(xiàn)象存在材料特異性，同時該結(jié)果也表明了草地早熟禾的種子萌發(fā)環(huán)境對其多胚苗頻率具有一定的影響。因此，前人所報道的Zn2+、H2O2、DMSO、Co60-Y以及外源激素是否能提高草地早熟禾的多胚率，適宜的濃度和處理方式等問題依然需要進(jìn)一步的試驗后才能確定。

4 結(jié)論

通過對去除稃殼的7個甘肅野生草地早熟禾材料的發(fā)芽特性和多胚苗率分別于15℃、20℃、25℃和30℃條件下的統(tǒng)計分析表明，草地早熟禾的發(fā)芽特性和多胚苗頻率隨著材料來源、萌發(fā)溫度和種子狀態(tài)的不同而異。其中隴南和甘谷種子在所有處理下其多胚率均無顯著差異，以省時、省力、經(jīng)濟(jì)的原則篩選出其余材料多胚率最高的萌發(fā)條件分別為：甘南和定西種子為30℃，且前者需要去除稃殼；清水和肅南種子為25℃，且后者需要去除稃殼；秦州種子為20℃。具體的草地早熟禾材料多胚率最高的萌發(fā)條件不盡相同，需提前進(jìn)行試驗才能確定其最適萌發(fā)條件。