環(huán)狀RNA的生物學功能及其在家禽中的研究進展

王衛(wèi)振，鄧占釗，辛國省，蔡正云，顧亞玲，張 娟*

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021；2.彭陽縣畜牧技術推廣服務中心,固原 756599；3.寧夏大學生命科學學院 寧夏飼料工程技術研究中心，銀川 750021)

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)與線性RNA相比不具有3′端ploy(A)和5′端帽子，在真核生物組織或細胞中豐富、穩(wěn)定表達，對RNA外切酶(RNase R)具有抗性[1-2]。circRNA作為內源性非編碼RNA (non-coding RNAs,ncRNAs)還具有高度保守性[3-4]。雖然circRNA早在1976年就被發(fā)現(xiàn)，由于circRNA不具有游離的3′和5′端，無法通過依賴于多聚 poly(A)的分子技術檢測到；同時，環(huán)化外顯子是經(jīng)反向剪接(back-splicing)形成共價環(huán)，異于經(jīng)典線性剪接，早期轉錄組分析的映射算法無法直接將測序得到的片段聯(lián)配到基因組上，使得在早期的研究中，circRNA被認為是線性轉錄本異常剪接的副產物，隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，circRNA的異常剪接是受到剪接機制嚴格調控的[3]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在人類疾病尤其是癌癥方面發(fā)揮著重要的生物學功能，成為RNA領域研究的新熱點。伴隨著高通量測序技術的普及和應用，越來越多的circRNA被鑒定出來。在未來，研究這些不同尋常分子的關鍵挑戰(zhàn)是如何發(fā)揮其功能。本文綜述了circRNA的研究簡史、種類、可變剪接、生物學功能及在家禽中的研究進展，以期為在家禽中深入研究circRNA提供理論基礎。

1 circRNA的研究簡史

基于PubMed數(shù)據(jù)庫，本文梳理了1971年之后circRNA的研究進程。1971年，Diener[5]在馬鈴薯塊莖病中發(fā)現(xiàn)一種類病毒，令人不解的是這種病毒的RNA呈環(huán)形結構；1976年，基于電子顯微鏡分析，在植物類病毒和仙臺病毒中發(fā)現(xiàn)共價閉合circRNA分子[6-7]，至此，一種全新的、未知的RNA出現(xiàn)在研究者的視野。隨后，在人類抑癌基因DDC、ETS-1、小鼠Sry基因、大鼠細胞色素P450、2C24基因中都發(fā)現(xiàn)異常剪接轉錄本形成circRNA[8-11]。2012年，Salzman等[12]對人類多種類型細胞數(shù)百種基因進行RNA-seq測序證實，circRNA是基因表達程序的普遍特征。對于circRNA的功能研究最早報道于1988年，在肝炎病毒中發(fā)現(xiàn)具有開放閱讀編碼框(ORF)的circRNA編碼抗原多肽P24Delta和P27Delta[13]；真核生物circRNA可在核糖體上翻譯啟動，前提是circRNA具有內部核糖體進入位點(IRESs)，才能在ORF上合成多肽鏈[14]。Hansen等[15]首次證明，circRNA可以作為miRNA的海綿，競爭性吸附miRNA，提高miRNA的靶標水平。circRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究為ncRNAs研究注入新的活力，也使得ncRNA在轉錄后的調控網(wǎng)絡更加復雜化、多樣化。circRNA作為一種新興功能大分子，為生命科學領域的探索掀開嶄新的一頁。

2 circRNA的分類

根據(jù)基因注釋信息，circRNA大部分來源于編碼蛋白質基因的外顯子，通常包含1～5個外顯子[16]，也有一些circRNAs來源于內含子、非編碼區(qū)、反義鏈、3′非翻譯區(qū)(3′UTR)、5′非翻譯區(qū)(5′UTR)或基因間區(qū)[16-18]。依據(jù)序列來源將circRNA分為4種類型：僅由外顯子衍生的circRNA (exonic circular RNA,EciRNA)(圖1A～B)；僅由內含子衍生的circRNA (intronic circular RNA,ciRNA)(圖1D)；外顯子-內含子衍生的circRNA(exon-intron circular RNA,EIciRNA)(圖1C)[19]；基因間區(qū)circRNA (intergenic circular RNA)[19]。

A.單外顯子反向剪接形成EciRNA；B.脫去內含子，外顯子反向剪接形成多外顯子EciRNA；C.外顯子之間保留內含子形成EIciRNA；D.內含子套索結構逃避脫支和降解形成ciRNAA.Single exon back splicing to form EciRNA;B.Removal of introns，back splicing of exons to form multiple exon EciRNA;C.Introns are retained between exons to form EIciRNA;D.Intron lariat structure escapes debranching and degradation to form ciRNA圖1 不同亞型circRNA示意圖Fig.1 Schematic representation of different subtypes of circRNA

3 circRNA生物發(fā)生機制

基因轉錄后的pre-mRNA要經(jīng)過復雜的加工才能形成成熟的mRNA(圖2A)。單個基因位點經(jīng)過可變剪接(alternative splicing)產生多種類型的circRNA(圖2B～G)。目前，已報道的circRNA的生物發(fā)生機制有5種：1)內含子配對驅動環(huán)化 (直接反向剪接模型)[4]；2)套索驅動環(huán)化(外顯子跳越模型)[4]；3)RNA結合蛋白(RBPs)驅動環(huán)化[20]；4)重 剪接驅動環(huán)化[21]；5)反式元件驅動環(huán)化[22]。此外，circRNA的發(fā)生還受到聚合酶Ⅱ(Pol-Ⅱ)[23]、聚合酶Ⅲ(Pol-Ⅲ)[24]、RNA編輯酶腺苷脫氫酶(ADAR)[1,25]、內含子中G-U擺動堿基對[26]、poly(A)的延伸[26]等影響。

3.1 內含子配對驅動環(huán)化和套索驅動環(huán)化

在內含子配對驅動環(huán)化中(圖2C)，兩側翼內含子中反向互補串聯(lián)重復序列，如ALU元件、RCMs元件、ICSs元件等，能有效促進內含子互補配對環(huán)化[26]。在套索驅動環(huán)化中(圖2B)，pre-mRNA遵循經(jīng)典GU-AG法則剪接，規(guī)范剪接的pre-mRNA發(fā)生折疊，使非相鄰的外顯子相互靠近發(fā)生外顯子跳躍，經(jīng)反向剪接形成包含外顯子和內含子的套索前體，該前體通過內部剪接去除內含子，形成EciRNA[4]。在這兩種機制中，當內含子未被完全剪接，而保留在新生成的circRNA中時，就形成了EIciRNA[27]。

3.2 RNA結合蛋白驅動環(huán)化

RNA結合蛋白(RBPs)作為circRNA生物發(fā)生機制的激活劑或抑制劑在調控circRNA發(fā)生中的重要作用已經(jīng)被證實。震動蛋白(quaking,QKI)和盲肌蛋白(muscleblind,MBL/MBNL1)能與pre-mRNA側翼內含子中特定基序列結合，將側翼內含子連接在一起，這個過程類似于內含子配對驅動環(huán)化，不同的是，RBPs與特定位點結合后形成二聚體促進pre-mRNA環(huán)化[28-29](圖2D)。此外，免疫因子NF90/NF110[30]、異質核糖核蛋白L(HRNPL)[31]、FUS蛋白[32]、RNA結合基序蛋白20 (RBM20)[33]、脯氨酸-谷氨酰胺剪接因子(SFPQ)[34]等RBPs都能通過與特定位點結合促進環(huán)化。與之相反的是，作用于雙鏈RNA的ADAR1能將腺苷編輯為肌苷(A-I)，主要進攻對象為ALU元件，導致雙鏈RNA發(fā)生U-I錯配，削弱雙鏈RNA的結合能力進而抑制circRNA的產生[1,25](圖2E)。

3.3 重剪接驅動環(huán)化

在腫瘤基因中報道了一種異常剪接方式，對成熟的mRNAs進行重剪接產生circRNA[21]。值得注意的是，這種重新剪接能夠使較遠的弱替代剪接位點替代真實的強剪接位點，形成大型套索外顯子環(huán)(圖2F)，從而導致mRNA片段的缺失[21]。乳腺癌細胞人類腫瘤易感基因TSG101的mRNA第2外顯子至第9外顯子重剪接組成內源性的circRNA[21]。

3.4 反式元件驅動環(huán)化

ciRNA的生物發(fā)生機制不同于EciRNA和EIciRNA，它由反式元件(trans-acting splicing elements)驅動環(huán)化而來。在內含子中的特殊序列5′SS附近的7nt-GU富集元件和3′SS附近的11nt-C富集元件，在反向剪接中，兩種元件結合形成包含內含子的套索結構，通過2′,5′-磷酸二酯鍵共價連接成環(huán)，接著下游3′端的殘余序列在脫支酶和核酸外切酶作用下降解[17,19,35]。一般而言，內含子套索會在脫支酶的作用下開環(huán)，隨后被降解，但含有7nt-GU富集元件和11nt-C富集元件的內含子能阻止脫分支酶的結合[17](圖2G)。

3.5 其他因子調控的環(huán)化

circRNAs來源于Pol-Ⅱ轉錄本，抑制Pol-Ⅱ活性，發(fā)現(xiàn)直接從內源性的pre-mRNA到circRNA環(huán)化效率極低，深入研究發(fā)現(xiàn)，反向剪接與Pol-Ⅱ的延伸率呈正相關，并受順式元件(cis-acting splicing regulatory elements)的調控[23]。此外，有報道顯示，切割或聚腺苷酸化抑制Pol-Ⅱ終止轉錄，circRNA的表達水平升高，原因在于轉錄本通讀延伸至下游基因，并進行反向剪接[36]。Pol-Ⅲ作為轉錄中常見的聚合酶，也能啟動高效環(huán)化[24,37]。在內含子反向重復序列中出現(xiàn)的G-U擺動堿基對及poly(A)的延伸都會限制circRNA的形成[26]。在古細菌中發(fā)現(xiàn)內含子的環(huán)化至少涉及兩種酶，特定的核酸內切酶和連接酶，核酸內切酶特異性識別切割凸起-螺旋-凸起(B-H-B)結構；連接酶連接外顯子，并將剪切暴露出2′,3′-環(huán)磷酸和5′-羥基末端連接轉化為結合型環(huán)磷酸鹽，形成7nt的發(fā)夾環(huán)[38]。也有報道證實，pre-tRNA能剪接成tRNA內含子circRNA (trciRNA)，這需要保守的tRNA序列基序和連接-內切酶復合體參與[39]。

4 circRNA的功能

cirRNA在調控基因表達中發(fā)揮重要作用。有證據(jù)表明，circRNA不僅自身與轉錄因子結合參與基因表達調控，還可以靶向吸附miRNA或與RBPs結合作為轉錄調節(jié)因子影響基因表達[15,17,19-20]。circRNA可以作用轉錄因子調控親本基因轉錄(圖3A)，small RNA干擾或RNase H反義寡核苷酸(ASOs)34靶向敲除EIciRNA導致親本基因中mRNA 表達水平下降[19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，EIciRNA通過與Pol-Ⅱ和U1SNP在親本基因啟動區(qū)域結合啟功親本基因順式表達[19]。miRNA是長度僅有22 nt左右的ncRNA，在基因轉錄后調控中發(fā)揮重要作用，miRNA介導的轉錄后調控與mRNA的UTRs結合阻礙翻譯的進行或降解mRNA[40-41]。circRNA富含miRNA的競爭性靶點，發(fā)揮類似海綿作用吸附miRNA (圖3B)，從而阻斷miRNA與mRNA的結合，調節(jié)miRNA對基因轉錄后調控[2,15,35]。在人腦和小鼠腦中小腦變性相關蛋白1反義(CDR1as)環(huán)狀轉錄本ciRS-7富含70多個保守miRNA靶點，作為miR-7的海綿以miR-7依賴性的AGO2蛋白締合，完全抵抗miRNA介導的靶點失穩(wěn)，強烈抑制miR-7活性，提升miR-7靶基因水平[15,35]。已經(jīng)證實circRNA能與RBPs結合，形成circRNA-RBPs復合體發(fā)揮生物學功能(圖3C)。

A.pre-mRNA通過經(jīng)典剪接生成mRNA；B.套索驅動環(huán)化，pre-mRNA折疊成套索前體，套索前體反向剪接生成circRNA；C.內含子配對驅動環(huán)化，兩側翼內含子在反向互補串聯(lián)重復序列ALU元件作用下堿基互補配對，經(jīng)反向剪接生成circRNA；D.RBPs驅動環(huán)化，RBPs與側翼內含子特定基序結合促使兩側翼內含子形成二聚體環(huán)化，經(jīng)反向剪接生成circRNA；E.ADAR1破壞反向互補配對堿基，發(fā)生U-I錯配，削弱雙鏈結合能力抑制環(huán)化；F.重剪接驅動環(huán)化，成熟mRNA經(jīng)反向剪接形成套索外顯子環(huán)，導致mRNA片段缺失；G.反式元件驅動環(huán)化，含有內含子反式元件形成的套索結構逃避脫支和降解，形成ciRNAA.pre-mRNA generated mRNA by classical splicing;B.Lariat driven circularization,pre-mRNA folds into lariat precursors,and back splicing of lariat precursors to generated circRNA;C.Intron pairing driven circularization,the base complementary pairing of two flanking intronic in the action of reverse complementary tandem repeat sequence ALU element,and circRNA is generated by back splicing;D.RBPs driven circularization,binding of RBPs to flanking intronic specific sequence motifs induces dimerize cyclization of flanking intronic,and circRNA is generated by back splicing;E.ADAR1 destabilizes reverse complementary pairing bases,generates U-I mismatches,and weakens duplex binding ability to inhibit cyclization;F.Resplicing drives circularization,mature mRNA is back splicing to form a larita exon loop,causes deletion of mRNA fragments;G.Trans acting splicing elements driven cyclization,the larita structure formed by the intron trans acting splicing element escapes debranching and degradation to form ciRNA圖2 circRNA驅動環(huán)化示意圖Fig.2 Schematic representation of circRNA driven circularization

ciRS-7結合miR-671激發(fā)ciRS-7的解環(huán)和AGO2介導的mRNA沉默，從而使吸附的miR-7脫靶得以釋放[15,35,42]。circ-Foxo3與 CDK2和p21蛋白結合形成三元復合體阻斷CDK2的功能抑制細胞周期進程[43]。

circRNA作為ncRNA并非不能編碼蛋白質，目前已知circRNA依賴于以下兩種機制翻譯。1)N6-甲基腺苷甲基化修飾(m6A)[44-45](圖3D)；2)IRSEs或原核生物核糖體結合位點[46-48](圖3E)。m6A是RNA堿基修飾中最豐富的存在，有報道證實，人細胞內源性circRNA經(jīng)m6A修飾促進內源性circRNA翻譯[44]。共識的m6A基序富集于大量circRNA上，使circRNA不依賴于帽子進行翻譯，這種受m6A驅動的翻譯在circRNA中普遍存在，并依賴起始因子eIF4G2和m6A閱讀器YTHDF3，被甲基轉移酶METTL3/14增強，被去甲基酶FTO抑制[44]。一項在膠質母細胞瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，circ-SHPRH編碼的SHPRH-146aa通過保護全長的SHPRH蛋白免受泛素蛋白酶的降解，從而抑制癌細胞的增殖和致瘤性[46]。對果蠅內源性circMBL1的研究發(fā)現(xiàn)，核糖體-circMBL1 UTR具有允許不依賴于帽子結構在體內翻譯的能力[47]。重要的是，circMbl和一些Mbl mRNA 亞型在突觸中翻譯，circMbl的翻譯在果蠅大腦中可能發(fā)揮重要作用，但Mbl和circMbl分子編碼的蛋白質不包含可識別的肽信號序列[47]。在小鼠和人體細胞中鑒定的circZNF609包含一個從起始密碼子開始的ORF，circZNF609與重鏈多核糖體結合，并以剪接依賴性和帽依賴性的方式通過ORF編碼蛋白質[48]。但對circ-ZNF609衍生蛋白的分子活性及它是否有助于調節(jié)或控制ZNF609衍生蛋白的活性還沒有進展，circ-ZNF609編碼的蛋白質缺乏鋅指結構域提示它可以作為顯性-陰性競爭者或作為替代ZNF609復合物形成的調節(jié)劑[48]。

circRNA通過與線性RNA競爭調控親本基因的選擇性剪接 (圖3F)，果蠅MBL/MBNL1蛋白第二外顯子側翼內含子富含MBL蛋白亞型結合位點，過表達MBL-A，內源性circ-MBL增加13倍而mRNA表達水平降低2倍[20]。顯然，MBL蛋白促進了circ-MBL生成，使反向剪接更具競爭力。擬南芥SEP3基因第6外顯子生成的circRNA強烈結合親本基因DNA基因座，形成RNA-DNA雜合體R-loop結構，R-loop結構抑制雜合體區(qū)段轉錄，發(fā)生跨外顯子選擇性剪切，促進轉錄本突變體SPE3.3的產生[49]。

一些circRNAs被發(fā)現(xiàn)調節(jié)表觀遺傳基因表達相關的異常甲基化和組蛋白修飾 (圖3G)。晚期乳腺癌中ETS轉錄因子家族成員FLI1啟動子染色質復合物外顯子產生一個circRNA，稱作FECR1[50]。circFECR1利用正反饋機制在啟動子的CpG島誘導DNA低甲基化激活FLI1，circFECR1募集雙加氧酶-1(TET1)到FLI1，誘導DNA脫甲基，circFECR1還通過與DNA甲基轉移酶-1(DNMT1)結合并下調DNMT1，DNMT1是維持DNA甲基化關鍵酶[50]。hsa_circ_0012919是自身免疫病系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的一種潛在生物標識物，hsa_circ_0012919下調降低腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)CD70和CD11a的表達，上調DNMT1的表達，逆轉CD4+T細胞中CD70和CD11a的DNA甲基化不足[51]。

circRNA除了上述生物學功能外，在臨床醫(yī)學上還具有新興作用——生物標記物，尤其在癌癥的發(fā)生和發(fā)展方面。circRNA的穩(wěn)定性、保守性、普遍性和特異性使其成為潛在的有、價值的腫瘤預后和診斷生物標志物，其在腫瘤細胞中的功能和調節(jié)作用使其成為腫瘤治療的靶點。circFoxo3在乳腺腫瘤組織中普遍下調，并可能抑制腫瘤生長和癌細胞活性[52]。circ-FBXW7在膠質母細胞瘤組織中表達下調，并與膠質母細胞瘤患者的總體生存率相關，并且circ-FBXW7編碼的FBXW7-185aa可以通過降低C-myc的半衰期，抑制膠質瘤細胞周期阻滯和增殖[53]。

A.circRNA調控親本基因轉錄；B.circRNA充當miRNA的海綿；C.circRNA與RBP結合；D-E.circRNA編碼蛋白質；F.調控親本基因的選擇性剪接；G.表觀遺傳修飾，調控DNA甲基化A.circRNA regulates parental gene transcription;B.circRNA acts as miRNA sponge;C.circRNA binds to RBP;D-E.circRNA encoded proteins;F.Regulate the selective splicing of parental genes;G.Epigenetic modification,regulating the DNA methylation圖3 circRNA功能示意圖Fig.3 Schematic representation of circRNA function

5 circRNA在家禽方面的的研究進展

在各種肉制品中，由家禽衍生出的產品是人類在日常生活中的重要食品來源之一。目前，禽肉已經(jīng)取代牛肉成為世界上第二大消費肉類，消費水平僅次于豬肉。家禽的經(jīng)濟性狀、氧化應激與疾病免疫是家禽養(yǎng)殖行業(yè)盈利和規(guī)避風險的著力點。最近的研究提示，在家禽的經(jīng)濟性狀、氧化應激與疾病免疫等領域都不難發(fā)現(xiàn)circRNA的蹤跡。

5.1 circRNA調控家禽的肌細胞增殖與分化

肌細胞的增殖與分化是家禽生長發(fā)育的基礎，但肌細胞的增殖與分化受一系列復雜因素的影響，如基因、細胞因子、ncRNAs的調控[54]。circRNA作為ncRNAs在家禽肌細胞發(fā)生中的作用日益凸現(xiàn)。Ouyang等[55]對不同胚齡雞胚骨骼肌發(fā)育過程中circRNA的表達進行RNA-seq測序，鑒定出462個 差異表達circRNAs，一些差異circRNAs來源基因與肌肉生物學進程有關，并證實circRBFOX2S與miR-206相互作用促進細胞增殖。Chen等[56]在對成纖維細胞因子受體2(FGFR2)的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因3～6號外顯子產生的circFGFR2在雞胚骨骼肌發(fā)育中差異表達；進一步探究該circRNA在雞胚發(fā)育中的作用機制發(fā)現(xiàn)，circFGFR2過表達促進成肌細胞和QM-7細胞增殖，加速生肌決定因子1(MYOD1)、肌細胞生成素(MYOG)的表達和肌管的形成，而敲除circFGFR2對成肌細胞則有相反作用；并且circFGFR2能夠直接靶向miR-133a-5p和miR-29b-1-5p兩個miRNAs，抑制其表達和活性，解除對成肌細胞增殖和分化的抑制作用。為確定circRNA在雞胚胎骨骼肌發(fā)育中的機制，Shen等[57]對4個不同胎齡肉雞和蛋雞的胸肌進行RNA-seq測序，由TMTC1基因轉錄而來的circTMTC1在不同胚齡表達水平蛋雞顯著高于肉雞，對circTMTC1敲除后加速雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化；miR-128-3p能夠靶向MSTN基因，抑制其表達，促進雞骨髓間充質干細胞分化，而circTMTC1則通過吸附miR-128-3p抑制雞胚胎干細胞分化。這些研究說明，circRNA廣泛參與肌細胞發(fā)生過程中的調控。

5.2 circRNA調控家禽的卵泡發(fā)育

卵泡發(fā)育是決定家禽生殖性能的關鍵因素，但卵泡發(fā)育受到顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞的共同作用，在轉錄水平也涉及到circRNA的調控。Shen等[58]在4個發(fā)育層次卵泡的卵泡膜細胞上鑒定到14 502個circRNAs，有5 622個circRNAs分布在多個層次卵泡膜細胞中；在與生殖相關的通路中都富集到差異表達circRNAs和mRNA，包括TGF-β信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂和血管平滑肌收縮；與此同時，Shen等[59]在對4個不同發(fā)育層次雞顆粒細胞RNA測序后發(fā)現(xiàn)，差異表達的circRNAs呈現(xiàn)組織特異性和階段特異性的動態(tài)變化。對DEcircRalGPS2的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，來源于RalGPS2基因的3個 差異circRNAs可能共享相同的miRNA作為海綿。Wu等[60]對鴨白卵泡和黃卵泡卵測序分析發(fā)現(xiàn)，共預測到4 204個circRNAs，14個circRNAs在兩種卵泡中差異表達；Wu等[60]研究表明，aplacirc_(013267)可促進鴨顆粒細胞凋亡，aplacirc_(013267)能直接結合并抑制apla-mir-1-13，上調血小板凝血酶蛋白1表達促進顆粒細胞凋亡。綜上所述，circRNA在家禽卵泡發(fā)育中具有潛在的作用，并且circRNA可作為了解卵泡發(fā)育的新途徑。

5.3 circRNA調控家禽的疾病與免疫

研究證實，circRNA能與免疫應答基因相互作用，介導疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，并可作為生物標記物參與疾病診斷[61-63]。病毒引起的傳染性疾病會在家禽養(yǎng)殖業(yè)中造成毀滅性的經(jīng)濟損失，其中以馬立克病毒(marek disease virus,MDV)、禽白血病病毒亞群(avian leukosis virus subgroup,ALV-J)為最。為揭示ncRNAs在疾病中的調控作用，對雞MDV感染腫瘤脾、MDV感染無損傷存活脾、健康脾進行RNA-seq測序顯示，鑒定出的2 169個circRNAs有113個差異表達，對circRNA/LncRNA-miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，內源競爭RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)參與腫瘤調控[62]。在circRNA-miRNA-mRNA調控網(wǎng)絡中，circZMYM3與7個靶向免疫基因的miRNAs互作，表明ncRNAs介導免疫應答基因的調控網(wǎng)絡[64]。在感染ALV-J的雞中發(fā)現(xiàn)，circRNA與ALV-J誘導的腫瘤形成有關，并可能有助于介導雞腫瘤的誘導和發(fā)展[61,63]。對ALV-J抗性雞和ALV-J易感雞肝組織進行測序，并對在抗性雞中12個上調的circRNAs的前5個miRNAs靶基因進行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)靶基因主要參與免疫途徑[61]。同樣，Qiu等[63]對ALV-J的研究發(fā)現(xiàn)，比較差異表達的circRNAs的來源基因和mRNA，并進行內源競爭RNA網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，幾個與腫瘤和免疫相關的基因同時存在于差異mRNA和circRNAs的來源基因中，并參與內源競爭RNA調控網(wǎng)絡。

5.4 circRNA調控家禽的氧化應激

在現(xiàn)代家禽集約化養(yǎng)殖模式下，氨氣(NH3)作為一種具有強烈刺激性的有害氣體是禽舍內主要空氣污染物，嚴重影響家禽和工人的健康狀況[64]。有研究發(fā)現(xiàn)，長時間暴露于高濃度NH3環(huán)境中會導致家禽的嚴重應激反應，造成呼吸道損傷出血、肝損傷、脾損傷、胸腺損傷和免疫反應等[65]。Chen等[66]基于轉錄譜分析發(fā)現(xiàn)，在高NH3脅迫下，5個circRNAs和100個mRNAs顯著失調，并且GO結果表明，免疫反應和細胞因子調控因高NH3脅迫而失調，共表達分析發(fā)現(xiàn)，circRNA-mRNA調控網(wǎng)絡與氧化應激和炎癥反應緊密相關。高NH3脅迫下調了抗氧化基因GPx和GST4的表達，上調炎性基因IL-1、IL-6和IL-8的表達[66]。

5.5 circRNA調控家禽的肌內脂肪沉積

家禽以其肉質鮮美、風味獨特而受消費者青睞，而脂肪是決定肉質風味關鍵性因素。影響畜禽機體內脂肪含量的因素包括脂肪合成代謝和肌內脂肪沉積。有研究表明，肌內脂肪沉積受到circRNA調控，王莎莎[67]在對櫻桃谷鴨的誘導前后脂肪細胞的RNA測序中發(fā)現(xiàn)，大量ncRNAs差異表達，其中有66個circRNAs顯著上調，75個顯著下調；GO和KEGG結果顯示，差異基因大量富集在脂肪酸合成代謝，不飽和脂肪酸合成等通路中，進一步構建circRNA/LncRNA-miRNA-mRNA調控網(wǎng)絡為研究鴨脂肪沉積調控機制奠定基礎[67]。

6 展 望

借助于第二代高通量測序平臺，circRNA如雨后春筍般由無用的剪接垃圾走進研究者的學術殿堂。雖然大量的基礎研究已經(jīng)證實了circRNA的剪接機制和功能，但有一些問題仍亟待解決，如circRNAs的降解機制。目前，僅有有限的研究報道闡釋circRNA的降解，在這一方向的研究十分匱乏。Hansen等[42]報道了ciRS-7結合miR-671激發(fā)ciRS-7的解環(huán)降解和AGO2介導的的mRNA沉默，然而這是基于特定序列，對于成千上萬種circRNAs并不適用。Lasda和Parker[68]一項使用三細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA的代謝是通過胞外小體和微囊泡將聚集過量的circRNA從細胞中清除，對于這一降解機制是否適用于不同細胞定位circRNA的降解仍有待研究，此外，是否還存在其他降解機制或胞內排出機制也不可知。在circRNA的研究中大多僅限于轉錄組學，而對于多組學的聯(lián)合分析少之又少。如果在circRNA翻譯功能研究中聯(lián)合蛋白質組學和代謝組學，從多組學、多角度、多方向進行整合研究，可能會發(fā)現(xiàn)非常有研究價值的circRNA翻譯調控機制。目前，circRNA的研究對象主要集中在醫(yī)學領域生物標志物的研究，但circRNA在家禽等經(jīng)濟動物中的研究也在蓬勃興起，篩選家禽經(jīng)濟性狀中關鍵circRNA，深度挖掘circRNA在家禽經(jīng)濟性狀中的調控網(wǎng)絡，是未來circRNA在家禽研究中的重點突破對象。