肖榮　趙澄　張香港　吳濤　魏科　胡玨　盧芳國　秦裕輝

〔摘要〕 目的 探討湖南預(yù)防“新冠肺炎”2號方（簡稱“2號方”）的免疫調(diào)節(jié)作用與可能機制。方法 將30只BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、2號方干預(yù)組，每組10只。腹腔注射環(huán)孢菌素A（cyclosporin A， CsA）建立免疫缺陷小鼠模型，經(jīng)灌胃給臨床等效劑量的2號方水煎劑干預(yù)7 d后，常規(guī)法檢測胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、肺指數(shù)，ELISA法檢測血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α表達水平以及肺組織勻漿液中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2， ACE2）和血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）表達水平。結(jié)果 （1）與正常對照組比較，模型對照組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.01），胸腺組織萎縮、出現(xiàn)明顯的病理改變，并伴有血清中的IL-2、IFN-γ表達水平和肺組織勻漿液中ACE2含量顯著降低（P<0.05）以及血清中TNF-α表達水平和肺組織勻漿液AngⅡ表達水平顯著上升（P<0.05或P<0.01）;（2）與模型對照組比較，2號方干預(yù)組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P<0.01）、胸腺組織得到明顯的改善，血清中IFN-γ 表達水平顯著提高（P<0.01），肺組織勻漿中AngⅡ表達水平均顯著降低（P<0.01），脾臟指數(shù)和肺臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 2號方可能通過改善胸腺組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)IFN-γ、AngⅡ的表達水平而影響CsA所致免疫缺陷小鼠模型的免疫功能。

〔關(guān)鍵詞〕 免疫缺陷;新冠肺炎;免疫調(diào)節(jié);2號方;炎性因子

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.002

〔Abstract〕 Objective To explore the immunomodulatory effects and possible mechanisms of Hunan No.2 prevention prescription of "COVID-19" （No.2 prescription"）. Methods 30 BALB/c mice were randomly divided into normal control group， model control group and No.2 prescription intervention group， with 10 mice in each group. The immune deficiency model of mice was established by intraperitoneal injection of cyclosporin A （CsA）. After 7 days of intervention with clinical equivalent dose of decoction of No.2 prescription， thymus index， spleen index and lung index were detected by routine method， and the contents of IL-2， IFN-γ and TNF-α in serum and the levels of angiotensin converting enzyme 2 （ACE2） and angiotensin Ⅱ （AngⅡ） in lung homogenate were detected by ELISA. Results （1） Compared with the normal control group， the thymus index of the model control group was significantly decreased （P<0.01）， the thymus tissue atrophy and obvious pathological changes were observed， and the levels of IL-2 and IFN-γ in serum and as well as ACE 2 in lung tissue homogenate were significantly decreased （P<0.05）. Meanwhile， the expressions of TNF-α in serum and AngⅡ in lung tissue homogenate were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. （2） Compared with the model control group， the thymus index of No.2 prescription intervention group was significantly increased （P<0.01）， thymus tissue got obvious improvement， IFN-γ expression level in serum increased significantly （P<0.01）， the level of Ang Ⅱ in lung tissue homogenate was significantly decreased （P<0.01）. There were no statistical differences in spleen index and lung index （P>0.05）. Conclusion No.2 prescription may affect the immune function of CsA induced immunodeficiency mice by improving the structure of thymus and regulating the expression levels of IFN-γ and AngⅡ.

〔Keywords〕 immunodeficiency; COVID-19; immunomodulatory; No.2 prescription; inflammatory factors

眾所周知，機體的免疫狀態(tài)是影響疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素。我國“新冠肺炎”疫情防控所取得的階段性勝利與中醫(yī)藥的推廣應(yīng)用密切相關(guān)。自國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》起，中藥就被納入了“新冠肺炎”疫情防控的診療措施中[1]。全國各省、市堅持中西醫(yī)結(jié)合防治，已取得良好效果[2]。經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)、湖南省中醫(yī)藥研究院專題研究，由國醫(yī)大師劉祖貽等多名中醫(yī)藥專家共同討論，分別制定出了預(yù)防新型冠狀病毒感染的、針對健康人群的“預(yù)防1號方”和針對體質(zhì)虛弱人群的“預(yù)防2號方”，兩個預(yù)防方劑在防御感染、控制病情發(fā)展、減輕癥狀、提高生活質(zhì)量等方面顯現(xiàn)出明顯效果[3-4]。為探析中醫(yī)藥防治“新冠肺炎”的效應(yīng)機制，本項目組制備免疫缺陷小鼠模型，研究湖南預(yù)防“新冠肺炎”2號方（簡稱“2號方”）的免疫調(diào)節(jié)，以期為中醫(yī)藥科學(xué)防治新發(fā)、突發(fā)冠狀病毒感染疾病的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1? 動物

SPF級4～5周齡BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2019-0009。實驗過程中對小鼠的處理措施已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實驗中心動物倫理委員會同意。

1.2? 主要藥物與試劑

（1）2號方組成：黃芪30 g，山銀花15 g，陳皮9 g，甘草7 g，大棗5枚（20 g）。黃芪（批號：CK20042901，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）、山銀花（批號：HY20050601，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）、陳皮（批號：2002049，安徽毫藥千草中藥飲品有限公司）、甘草（批號：NG20051202，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）、大棗（批號：2002270072，豪州市滬譙藥業(yè)有限公司），購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部。（2）環(huán)孢菌素A（cyclosporin A， CsA）（批號：191215，杭州中美華東制藥有限公司），以無菌生理鹽水稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，應(yīng)用劑量為20 mg/kg。（3）小鼠IL-2 ELISA試劑盒（批號：LOT20200904A）、小鼠TNF-α ELISA試劑盒（批號：LOT20200904A、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒（批號：LOT20200909A）、小鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2， ACE2）ELISA試劑盒（LOT20200911A）、小鼠血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）ELISA試劑盒（批號：LOT20200904A）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3? 主要儀器

PB1501-E型電子分析天平（Mettler公司）;Heraleus?Fresco21微量冷凍離心機（德國ThermoF isher科技公司）;DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備公司）;ELx800酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;Motic-BA400顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 實驗方法

2.1? 2號方水煎劑的制備

按照2號方組成準(zhǔn)確稱取藥材1劑（81 g）。先加入1 000 mL蒸餾水室溫浸泡30 min，待武火煮沸后，改文火煎煮30 min，過濾獲得一煎濾液;留取藥渣繼續(xù)加入1 000 mL蒸餾水，武火煮沸后改文火煎煮30 min，過濾獲得二煎濾液，合并兩次濾液，水浴濃縮至含生藥1.17 g/mL，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 模型建立與分組給藥

30只SPF級BALB/c小鼠，隨機分成3組：正常對照組、模型組對照組、2號方干預(yù)組，每組10只。除正常對照組外，其余各組小鼠腹腔注射CsA，劑量為20 mg/kg，隔日1次，共注射3次。正常對照組同步腹腔注射等量生理鹽水。每天定期觀察動物的一般癥狀以評判模型[5-6]，評判模型成功的當(dāng)天開始灌胃給藥。2號方干預(yù)組給藥方式為：0.2 mL/只，1次/d，連續(xù)灌胃1周，給藥劑量為等效劑量，即根據(jù)成人用藥量30 g/60 kg體質(zhì)量，按體表面積換算成小鼠的等效劑量為每日0.234 g/20 g[7]。正常對照組和模型對照組同步給予無菌生理鹽水灌胃。

2.3? 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

2.3.1? 胸腺、脾臟、肺臟指數(shù)檢測? 采用器官稱重法進行器官指數(shù)檢測。給藥結(jié)束后次日稱量各組小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出胸腺、脾臟、肺臟于電子分析天平上稱重。

器官指數(shù)=器官重量（mg）/體質(zhì)量（g）

2.3.2? 胸腺、脾臟、肺臟組織病理變化觀察? 將胸腺、脾臟、肺臟組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色、顯微鏡下觀測。

2.3.3? 血清細胞因子表達水平檢測? 眼球取血，4 ℃下靜置過夜，3 000 r/min離心10 min收集血清，ELISA試劑盒檢測血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α 水平。操作遵循試劑盒操作說明書進行，使用酶標(biāo)比色儀測定各反應(yīng)孔的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的濃度。

2.3.4? 肺組織勻漿液ACE2和AngⅡ表達水平檢測? 取適量肺組織1.0 g，加入9.0 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），用勻漿器制備10%的肺組織勻漿，3 000 r/min離心10 min收集上清，經(jīng)蛋白定量后分裝一份用于ACE2、AngⅡ表達水平檢測，剩余樣本置于-80 ℃冷凍存放備用。ELISA操作遵循試劑盒操作說明書進行。

2.4? 統(tǒng)計學(xué)分析

將收集的資料錄入SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以“x±s”表示，滿足正態(tài)分布者，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齊，組間兩兩比較采用LSD檢驗;方差不齊時，采用Dunnetts T3檢驗。不滿足正態(tài)分布者，采用非參數(shù)Kruskal-wallis檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 胸腺、脾臟、肺臟指數(shù)檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組小鼠的胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.01），脾臟指數(shù)和肺臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型對照組比較，2號方干預(yù)組小鼠的胸腺指數(shù)顯著上升（P<0.05）。見表1。

3.2? 胸腺、脾臟、肺臟組織病理變化觀察結(jié)果

正常對照組小鼠胸腺組織皮質(zhì)髓質(zhì)分界明顯，皮質(zhì)區(qū)淋巴細胞排列整齊，髓質(zhì)區(qū)可見胸腺小體;模型對照組小鼠胸腺組織皮質(zhì)變薄，淋巴細胞減少，細胞間隙增大，皮質(zhì)髓質(zhì)分界模糊;2號方干預(yù)組小鼠胸腺組織皮質(zhì)、髓質(zhì)分界較為清晰，皮質(zhì)區(qū)淋巴細胞排列規(guī)整，髓質(zhì)區(qū)胸腺小體明顯。正常對照組小鼠脾臟組織被膜均完整，脾小梁、白髓、紅髓組織結(jié)構(gòu)均清晰;模型對照組和2號方干預(yù)組小鼠脾臟組織未見明顯的病理改變;正常對照組小鼠肺臟組織的肺泡、肺泡隔形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，模型對照組和2號方干預(yù)組小鼠的肺臟亦未見明顯的病理改變。見圖1。

3.3? 血清細胞因子表達水平檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清中的細胞因子IL-2、IFN-γ表達水平顯著降低（P<0.01），TNF-α表達水平顯著增高（P<0.01）。與模型對照組比較，2號方干預(yù)組小鼠血清中的IFN-γ表達水平顯著升高（P<0.01），IL-2和TNF-α表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

3.4? 肺組織勻漿液ACE2和AngⅡ表達水平檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組肺組織勻漿液中ACE2表達水平顯著降低（P<0.05），AngⅡ表達水平顯著增高（P<0.01）。與模型對照組比較，2號方干預(yù)組小鼠肺組織勻漿液中ACE2表達水平無顯著性差異（P>0.05），而AngⅡ表達水平顯著降低（P<0.01）。見表3。

4 討論

CsA是臨床上廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)防治的一種免疫抑制劑。已有研究[5-6，8-9]證明：CsA可特異性地抑制CD4+ T細胞的增殖分化，CsA對細胞免疫和胸腺依賴性抗原的體液免疫有較強的選擇性抑制作用，并能抑制Th1型細胞產(chǎn)生IL-2、IL-3、IFN-γ等細胞因子的表達，影響T淋巴細胞表面結(jié)構(gòu)和識別功能，阻止T淋巴細胞的活化。機體抗病毒免疫過程主要依賴細胞免疫應(yīng)答，而2號方是針對體質(zhì)虛弱人群的中藥復(fù)方，因此，本課題組選用CsA建立免疫缺陷動物模型，以研究2號方的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)與機制。

胸腺是哺乳動物的中樞免疫器官，也是T細胞分化成熟的場地，其結(jié)構(gòu)及功能與機體狀態(tài)緊密相關(guān)，胸腺指數(shù)的變化直接反映機體細胞免疫水平的高低[10]。IL-2、IFN-γ是主要由Th1型細胞分泌產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)機體免疫作用的細胞因子，也是評價機體細胞免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo)[11]。本研究所制備的免疫缺陷小鼠模型，出現(xiàn)食欲減退、反應(yīng)遲鈍、毛失光澤等癥狀，胸腺組織萎縮、胸腺指數(shù)顯著降低，胸腺經(jīng)HE染色觀察可見胸腺皮質(zhì)變薄、皮質(zhì)髓質(zhì)分界模糊等變化，并伴有血清中的細胞因子IL-2、IFN-γ表達水平顯著降低。這些研究結(jié)果表明CsA成功建立了以細胞免疫缺陷為主的免疫缺陷小鼠模型。

ACE2可以將腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的AngⅡ降解成血管緊張素1-7而發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用。ACE2活性功能受阻將導(dǎo)致AngⅡ升高，而AngⅡ不僅是致纖維化因子，而且能夠刺激核增殖因子κB的表達，并進一步誘導(dǎo)炎癥因子（如：IL-1β、IL-6、TNF-α）、趨化因子（如：MCP-1、IP-10）等多種物質(zhì)的表達[12-15]。本研究中免疫缺陷小鼠模型血清中的TNF-α表達水平以及肺組織勻漿液AngⅡ表達水平顯著增高，這可能與ACE2活性下降有關(guān)，提示ACE2、AngⅡ可能是與免疫炎癥密切相關(guān)的指標(biāo)。

2號方中黃芪甘溫，大補脾肺之氣，固表實衛(wèi)，重用為君藥;陳皮味苦辛，性溫，理氣健脾、和中燥濕，合黃芪既能助其健脾之功，又使其補而不滯，為臣藥;山銀花辛涼，既有辛涼透邪、清熱解毒之效，又具芳香辟穢之功，為佐藥;大棗、甘草益氣健脾，合黃芪加強益氣、實衛(wèi)固表之功，甘草兼能調(diào)和諸藥，共為佐使。諸藥配伍，重在培固正氣，兼以辟穢化濕、清解熱毒[16]。本研究結(jié)果顯示：與模型對照組比較，2號方干預(yù)組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P<0.05），胸腺組織得到明顯的改善，血清中IFN-γ 表達水平顯著增高（P<0.01），肺組織勻漿中AngⅡ含量水平顯著降低（P<0.01）。以上結(jié)果表明2號方可能通過改善胸腺組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)IFN-γ、AngⅡ的表達水平而發(fā)揮對CsA所致免疫缺陷小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用。這可能是該方調(diào)節(jié)體質(zhì)虛弱人群免疫功能、降低新型冠狀病毒肺炎感染風(fēng)險的機制之一。然而，由于中藥復(fù)方有效組分豐富，作用機制復(fù)雜，相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機制仍有待進一步深入研究與探索。

參考文獻

[1] 中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會.國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案（第三版）的通知[EB/OL].（2020-01-28）[2020-11-11].http：//www.nhc.gov.cn/jkj/s7923/202001/470b128513fe46f086d79667db9f76a5.shtml.

[2] 徐? 旭，張? 瑩，李? 新，等.各地區(qū)中醫(yī)藥預(yù)防新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）方案分析[J].中草藥，2020，51（4）：866-872.

[3] 湖南省中醫(yī)藥管理局：關(guān)于印發(fā)《湖南省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥診療方案（試行第三版）》的通知 湘中醫(yī)藥函〔2020〕19號[EB/OL].（2020-02-03）[2020-02-18].http：//tcm.hunan.gov.cn/tcm/xxgk/tzgg/202002/t20200203_11168981.html.

[4] 湖南省中醫(yī)藥管理局.湘中醫(yī)藥函〔2020〕23號湖南省中醫(yī)藥管理局關(guān)于在全省機關(guān)、企事業(yè)單位、學(xué)校推廣使用中藥預(yù)防新型冠狀病毒感染的通知[EB/OL].（2020-02-10）[2020-11-11].http：//tcm.hunan.gov.cn/tcm/xxgk/tzgg/202002/t20200210_11175538.html.

[5] 劉吉勇，盧芳國，朱惠斌，等.應(yīng)用環(huán)孢菌素A制備小鼠免疫缺陷動物模型[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15（5）：1376-1378.

[6] 朱惠斌，盧芳國，黃順玲，等.湘A1號、2號對免疫缺陷動物免疫保護作用的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（4）：828-831.

[7] 賀石林，王? 鍵，王凈凈.中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)[M].長沙：湖南科技出版社，2003.

[8] 胡正軍.環(huán)孢菌素A體內(nèi)作用2 h對淋巴細胞亞群的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，38（11）：1308-1310.

[9] 吳? 潔，唐? 靜，謝偉敏，等.應(yīng)用環(huán)孢菌素A制備BALB/C小鼠肺癌模型的實驗研究[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，35（3）：268-270.

[10] 羅? 晶，郝? 鈺.免疫學(xué)基礎(chǔ)與病原生物學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2016.

[11] MITRA S， LEONARD W J. Biology of IL-2 and its therapeutic modulation： Mechanisms and strategies[J]. Journal of Leukocyte Biology， 2018， 103（4）： 643-655.

[12] SANTOS R A S， SAMPAIO W O， ALZAMORA A C， et al. The ACE2/angiotensin-（1-7）/MAS axis of the renin-angiotensin system： Focus on angiotensin-（1-7）[J]. Physiological Reviews， 2018， 98（1）： 505-553.

[13] ANGUIANO L， RIERA M， PASCUAL J， et al. Circulating ACE2 in cardiovascular and kidney diseases[J]. Current Medicinal Chemistry， 2017， 24（30）： 3231-3241.

[14] 黎秀芝，尹新華.ACE2/Ang（1-7）/Mas軸在心血管疾病中的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020，26（20）：3969-3975.

[15] PAZ OCARANZA M， RIQUELME J A， GARCíA L， et al. Counter-regulatory renin-angiotensin system in cardiovascular disease[J]. Nature Reviews Cardiology， 2020， 17（2）： 116-129.

[16] 秦裕輝，胡方林，葛金文.新冠系列方預(yù)防新型冠狀病毒感染用方探討[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，40（2）：129-133.