郝宏姣，王 鑫，田 瑤，蘭志鵬，周詩(shī)晨，劉曉男，鄭 瑞，王馨翊，張泗舉，欒維江

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

開花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變的重要過(guò)程.植物開花的時(shí)間主要受外界環(huán)境因素以及植物自身內(nèi)源基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的影響.外界環(huán)境因素包括溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)等，其中最主要的就是日照長(zhǎng)度，即光周期現(xiàn)象.光周期現(xiàn)象是植物對(duì)于長(zhǎng)短日照信號(hào)的不同反應(yīng).根據(jù)光周期對(duì)植物產(chǎn)生的不同影響可以將植物分為短日照植物（水稻、大豆等）、長(zhǎng)日照植物（小麥、擬南芥、短柄草、向日葵等）和日中性植物（棉花、月季等）[1-2].水稻作為一種主要的糧食作物，其產(chǎn)量受到開花時(shí)間的影響.水稻先抽穗再開花，因而其抽穗期決定了開花期.水稻是一種兼性短日照植物，短日照促進(jìn)抽穗；長(zhǎng)日照下水稻抽穗延遲，但仍可抽穗.最近20年來(lái)，在水稻中鑒定出了一系列花期調(diào)控相關(guān)基因，其中最重要的是成花素基因.成花素是一類小分子球狀蛋白，在葉片中合成，之后通過(guò)莖的韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到莖頂端分生組織，促進(jìn)開花[3-4].成花素基因的表達(dá)受到一系列基因的調(diào)控，初步形成了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò).短日照和長(zhǎng)日照下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)既有聯(lián)系又有不同[5]，共同解釋了為什么水稻在短日照條件下提早開花，而在長(zhǎng)日照條件下延遲開花.

在短日照條件下，成花素基因Hd3a受到其上游Hd1基因和Ehd1基因的正向調(diào)控在葉片中高表達(dá)[6-7]，所編碼的蛋白從莖的韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到莖頂端分生組織細(xì)胞中，與其受體14-3-3類蛋白及bZIP類轉(zhuǎn)錄因子OsFD1結(jié)合形成成花素激活復(fù)合體（florigen activation complex，F(xiàn)AC），進(jìn)一步促進(jìn)成花素下游成花身份基因OsMADS14/OsMADS15的轉(zhuǎn)錄[3-4]，從而促進(jìn)水稻在短日照條件下開花.在該調(diào)控通路中，Hd1編碼一種鋅指蛋白，與擬南芥COSTANS基因同源，在短日照條件下可以促進(jìn)Hd3a基因的表達(dá)[8].Ehd1編碼一個(gè)B型應(yīng)答效應(yīng)因子，它是水稻中特有的調(diào)節(jié)因子[9]，可以獨(dú)立于Hd1基因促進(jìn)Hd3a基因的表達(dá).另外，節(jié)律鐘基因OsGI編碼一個(gè)含有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，位于調(diào)控通路的上游，可以正向調(diào)控Hd1基因和Ehd1基因的表達(dá)[9-10].在長(zhǎng)日照條件下，Hd1基因功能發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，抑制成花素基因Hd3a的表達(dá)，從而抑制其下游成花身份基因OsMADS14/OsMADS15的表達(dá)而延遲水稻抽穗.Hd1功能逆轉(zhuǎn)需要Ghd7基因和DTH8基因的存在.Ghd7編碼一個(gè)含有CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在長(zhǎng)日照下高表達(dá)，抑制其下游Ehd1的表達(dá)，從而抑制下游成花素Hd3a表達(dá)，延遲水稻在長(zhǎng)日照條件下的抽穗[11].DTH8/Ghd8編碼一個(gè)HAP3亞家族的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與Hd1和Ghd7形成復(fù)合體，抑制Hd3a的表達(dá)[12].

雖然目前已經(jīng)初步建立了水稻開花基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但該網(wǎng)絡(luò)仍不完善，有待發(fā)掘和鑒定更多的調(diào)控基因.因此，篩選抽穗期突變體以及鑒定更多的開花調(diào)控基因，對(duì)完善水稻開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和解析開花控制機(jī)制有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值.本課題組前期從轉(zhuǎn)基因水稻株系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)早抽穗突變體，在長(zhǎng)日照和短日照條件下均表現(xiàn)出早抽穗并可以穩(wěn)定遺傳.為了克隆突變基因，本研究對(duì)突變體株系進(jìn)行了遺傳分析，利用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR技術(shù)（Tail-PCR），擴(kuò)增了T-DNA的側(cè)翼序列，克隆了候選基因.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

粳稻品種中花11（Oryza sativaL.ssp.Japonicacv.ZH11）及早抽穗突變體株系（zc1），均種植于天津師范大學(xué)試驗(yàn)田，保持田間常規(guī)管理.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變體的鑒定與遺傳分析

種植野生型水稻中花11和轉(zhuǎn)基因株系，在水稻生殖生長(zhǎng)階段記錄其抽穗期并拍照.同時(shí)單株提取野生型及轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，利用T-DNA上的特異基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定其是否攜帶有T-DNA.

1.2.2 T-DNA側(cè)翼序列的擴(kuò)增

采用文獻(xiàn)[13-14]中的Tail-PCR技術(shù)進(jìn)行T-DNA側(cè)翼序列擴(kuò)增.根據(jù)序列中的右邊界（right border，RB）端序列，由內(nèi)向外設(shè)計(jì)3條嵌套引物，即RB-0b、RB-1b和RB-2b，分別與4條簡(jiǎn)并引物（LAD1-1～LAD1-4）組合，進(jìn)行PCR反應(yīng).整個(gè)過(guò)程共有3輪PCR，采用文獻(xiàn)[13-14]中的擴(kuò)增體系，引物序列如表1所示.

表1 用于Tail-PCR的引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences used for Tail-PCR

3輪PCR擴(kuò)增完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離.選擇第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的特異性條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）進(jìn)行回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.2.3 側(cè)翼序列的比對(duì)分析與插入位點(diǎn)的確定

將測(cè)序結(jié)果首先與T-DNA序列進(jìn)行比對(duì)，去除T-DNA的邊界序列.然后將剩余側(cè)翼序列在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行同源性比較，得到其同源序列.將同源序列在水稻基因組注釋網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）進(jìn)行比對(duì)分析，得到側(cè)翼序列所屬的基因位點(diǎn)和座位號(hào)，從而確定TDNA的插入位點(diǎn).

1.2.4 突變體的分子鑒定

根據(jù)突變體中T-DNA插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)基因特異的引物ZC1-F1和ZC1-R1，與T-DNA上右端邊界引物RB-2b組合，對(duì)T-DNA插入株系中所有單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)是否攜帶T-DNA以及是純合還是雜合狀態(tài).如果單株為野生型，則只能用引物ZC1-F1和ZC1-R1擴(kuò)增得到基因特異的條帶；如果單株為T-DNA插入純合體，則只能用引物ZC1-F1和RB-2b擴(kuò)增得到基因序列與T-DNA序列的融合片段；如果單株為TDNA插入雜合體，則可以擴(kuò)增出以上2種片段.

PCR反應(yīng)總體系為25.0μL：Q5 High-Fidelity 2×Master Mix 12.5μL，引物ZC1-F1、ZC1-R1、RB-2b各1.25μL，模板DNA 1.0μL，水7.75μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s；58℃復(fù)性30 s；72℃延伸30 s；共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min.PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 早抽穗突變體zc1的表型鑒定與遺傳分析

種植突變體株系，發(fā)現(xiàn)突變體株系產(chǎn)生了表型分離，如圖1（a）所示.30個(gè)單株中，8株抽穗較早且株高較低，與野生型中花11相比抽穗期提前18 d左右；另外22株的抽穗期和株高與野生型中花11相比沒有明顯差異，將這些早抽穗植株命名為zc1（zaochou1）.正常抽穗植株與早抽穗植株的分離比為22/8，推測(cè)早抽穗可能是單基因控制的隱性性狀.χ2符合度測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，該比例符合3∶1的孟德爾分離比（χ2=0.05，P＞0.05）.由于水稻的抽穗期和日照長(zhǎng)度有關(guān)，為了分析該株系在短日照下的表型，又將該株系種植在自然短日照條件下，發(fā)現(xiàn)其抽穗期依然發(fā)生分離（早抽穗6株/正常抽穗20株），突變體zc1比野生型中花11早抽穗10 d，如圖1（b）所示.上述結(jié)果表明，zc1在長(zhǎng)日照和短日照條件下均呈現(xiàn)早抽穗表型.

圖1 zc1的早抽穗表型和抽穗期分析Fig.1 Phenotype and heading-date analysis of zc1

2.2 早抽穗表型與T-DNA共分離分析

由于早抽穗表型株系來(lái)源于轉(zhuǎn)基因材料，因此首先需要確認(rèn)該表型是否與T-DNA的插入有關(guān).提取所有30個(gè)單株的基因組DNA作為模版，對(duì)T-DNA中的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hyg）片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可以看出，在所有的8個(gè)早抽穗單株中，都擴(kuò)增出了目的條帶；在正常抽穗的22個(gè)單株中，15株擴(kuò)增出目的條帶，7株未擴(kuò)增出目的條帶.說(shuō)明這15株擴(kuò)增出目的條帶的正常抽穗植株中可能是TDNA雜合插入的，其中一條同源染色體上有T-DNA插入，而另一條同源染色體上沒有T-DNA插入.7株未擴(kuò)增出目的條帶的正常抽穗植株是純合野生型.此外，Hyg標(biāo)記基因片段有無(wú)的分離比率符合3∶1，符合一對(duì)顯隱性基因的分離比，說(shuō)明T-DNA以單拷貝的方式插入到水稻染色體中，如表2所示.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，早抽穗單株都攜帶T-DNA；而正常抽穗單株中，既有攜帶T-DNA的單株也有不攜帶T-DNA的單株.結(jié)合早抽穗突變體的遺傳分析結(jié)果（單基因控制的隱性突變），推斷早抽穗表型可能是由于T-DNA插入導(dǎo)致基因失活所致.早抽穗單株可能是T-DNA插入純合體；正常表型單株中，既有野生型也有T-DNA插入雜合體.

表2 T-DNA標(biāo)簽的卡平方檢驗(yàn)Tab.2 Chi-square test for T-DNA tags

2.3 T-DNA側(cè)翼序列的擴(kuò)增與候選基因的確定

為了鑒定T-DNA序列在水稻染色體上的插入位點(diǎn)，用Tail-PCR方法擴(kuò)增突變體中T-DNA的側(cè)翼序列.本研究設(shè)計(jì)了4組簡(jiǎn)并引物（LAD1-1～LAD1-4），分別與T-DNA序列上的引物（RB-0b、RB-1b、RB-2b）組合，進(jìn)行了3輪PCR擴(kuò)增.用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示.

圖3 Tail-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳及測(cè)序結(jié)果Fig.3 Amplification of Tail-PCR and flanking sequence of T-DNA in zc1 mutant

由圖3（a）可以看出，第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)了多個(gè)特異條帶.回收其中的4個(gè)特異性條帶，如圖3（a）圈中部分所示，進(jìn)行DNA序列測(cè)定.4個(gè)片段所得序列具有相似結(jié)果，其中一個(gè)結(jié)果如圖3（b）所示.

對(duì)所得測(cè)序結(jié)果除去T-DNA上的側(cè)翼序列之后，在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行blastn比對(duì)，結(jié)果表明側(cè)翼序列與水稻中一個(gè)類受體蛋白激酶LRR-RLK的序列完全一致.從水稻基因組注釋網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）上獲得了該序列所在的基因編號(hào)及全長(zhǎng)，命名為ZC1基因.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入到ZC1基因第一個(gè)外顯子的起始密碼子ATG后的第233個(gè)核苷酸之后，造成了編碼框中斷，如圖4（a）所示.為了進(jìn)一步確定T-DNA是否確實(shí)插入到ZC1基因的第一個(gè)外顯子上以及攜帶有T-DNA的單株是否純合，在插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)引物ZC1-F1，在插入位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)引物ZC1-R1，與T-DNA上的RB-2b引物組合，對(duì)所有的30個(gè)單株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4（b）所示.由圖4（b）可以看出，所有突變體單株（m1～m8）只能擴(kuò)增出引物RB-2b和ZC1-R1之間584 bp條帶，說(shuō)明是T-DNA插入純合體植株.未攜帶T-DNA的正常表型單株（n1、n4、n7、n8、n13、n15、n22）只擴(kuò)增出引物ZC1-F1和ZC1-R1之間的1 235 bp條帶，說(shuō)明是純合野生型植株.攜帶T-DNA的正常表型單株（n2、n3、n5、n6、n9～n12、n14、n16～n21）擴(kuò)增出584 bp和1 235 bp 2個(gè)條帶，說(shuō)明是T-DNA插入雜合體植株.該結(jié)果與上述標(biāo)記基因檢測(cè)結(jié)果完全吻合，表明T-DNA確實(shí)插入到ZC1基因中.

圖4 利用三引物PCR檢測(cè)T-DNA插入位點(diǎn)純合性Fig.4 Homozygosity test of T-DNA insertion using tri-primer PCR

3 討論與結(jié)論

突變體是研究基因功能的重要材料，水稻中許多重要的開花調(diào)控基因等都是從突變體中克隆的.本研究從轉(zhuǎn)基因材料中鑒定了一個(gè)早抽穗突變體，在短日照和長(zhǎng)日照下均表現(xiàn)為早抽穗表型.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有突變體單株都攜帶了T-DNA序列，且在整合位點(diǎn)上是純合的.T-DNA插入造成了富亮氨酸類受體蛋白激酶ZC1基因的編碼框中斷，導(dǎo)致了后者的功能喪失.

類受體蛋白激酶是生物中一類重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，由胞外受體結(jié)構(gòu)域（extracellular domain）、中間跨膜區(qū)（transmembrane domain，TM）以及胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域（cytoplasmic domain）3個(gè)基本的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[15-16].胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域相當(dāng)保守，主要是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有磷酸化結(jié)合位點(diǎn).類受體蛋白激酶主要通過(guò)絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化傳遞光、病原體侵入、低溫、干旱、激素等信號(hào)[17-18].位于中間的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域起著連接胞內(nèi)外信號(hào)傳遞以及將蛋白綁定在膜上的功能，由22～28個(gè)氨基酸構(gòu)成.而胞外區(qū)的受體結(jié)構(gòu)域是非保守的，不同類型的類受體蛋白激酶胞外區(qū)的氨基酸序列差異很大，用于識(shí)別和接收不同的胞外信號(hào)[19].越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，類受體蛋白激酶在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、參與植物對(duì)外界刺激的抗性和植物激素信號(hào)傳遞過(guò)程中起著重要作用.在水稻中，類受體蛋白激酶參與了花的發(fā)育[20]、抗病防御反應(yīng)[21-22]、非生物脅迫響應(yīng)[23-24]、激素信號(hào)傳遞[25-26]等過(guò)程.預(yù)測(cè)水稻中有超過(guò)1 131個(gè)類受體蛋白激酶基因[27]，大多數(shù)的功能還沒有得到鑒定.已知的水稻抽穗期調(diào)控基因中，大多數(shù)是轉(zhuǎn)錄因子類或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控的協(xié)作因子，蛋白激酶類基因鮮見報(bào)道，僅有2個(gè)編碼酪蛋白激酶（casein kinases I and 2α）的基因Hd6和Hd16參與水稻抽穗期調(diào)控[28-29].本研究推測(cè)類受體蛋白激酶基因ZC1的T-DNA插入突變可能導(dǎo)致了水稻早抽穗表型.下一步將對(duì)突變體進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，并且創(chuàng)制ZC1的等位突變體，進(jìn)行ZC1的功能驗(yàn)證，確認(rèn)類受體蛋白激酶基因ZC1是否負(fù)責(zé)早抽穗表型的變異.