蔣 藝，薛文秀，尚曉碩，鐘濱霞，鄒金華

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

鎘（cadmium，Cd）是重金屬污染中毒性最大、分布最廣泛的污染物之一[1].Cd是植物非必需的礦物質(zhì)元素，被植物根系吸收后會在植物體內(nèi)進行一系列的遷移和積累，長期的Cd積累會對植物產(chǎn)生一定的毒害作用，過量的Cd則會導致細胞損傷，使植物生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生改變，衰老甚至死亡.Ca是植物生長發(fā)育所必需的大量元素，不僅與植物營養(yǎng)器官的發(fā)育有關，而且關系到花粉萌發(fā)和果實器官的脫落[2].Ca直接參與細胞分裂過程，Ca缺乏會降低細胞分裂指數(shù)，從而影響植物生長[3].同時Ca2+在眾多的第二信使中處于樞紐地位，參與真核細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導途徑，細胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+對細胞的生存與凋亡具有重要作用[4].相關研究表明，外源Ca對處于逆境脅迫下的植物有重要緩解作用，它可以減輕植物在低溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫等逆境中受到的傷害[5].

柳屬（Salix）植物資源豐富，對于生態(tài)環(huán)境的適應性極強，廣泛分布于全世界.在我國約有200多種，分布于東北、西北和華北地區(qū).柳樹對多種重金屬有較高的耐受性和累積量，并且培養(yǎng)周期短，易進行無性繁殖，可作為植物修復的候選物種.旱柳（Salix matsudanaL.）作為柳屬常見品種，在重金屬污染土壤和水體的植物修復方面具有廣闊的發(fā)展前景和生態(tài)效應[6].在利用旱柳進行野外Cd污染土壤的植物修復實踐中，提高Cd污染區(qū)植株的成活率和緩解Cd對植物生長發(fā)育的毒害作用至關重要.為了探究添加外源Ca對旱柳中Cd毒害的緩解作用機理，本研究利用差速離心技術、化學試劑逐級提取法及電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-AES），分析不同Cd和Ca處理條件下旱柳各器官中Cd、Fe、Mn的含量以及根、葉不同亞細胞組分和不同化學形態(tài)的Cd含量，從而為植物修復重金屬污染實踐提供一定的理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

在天津師范大學生物科技園內(nèi)選取長勢較好、粗細均勻的旱柳，剪取20 cm長的枝條.

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)與處理

選取長勢較好的旱柳短枝分成4組，每組32枝，把短枝固定在KT板上，分別放置于4個容量相同的盛有6 L自來水的培養(yǎng)盆（60 cm×40 cm）中進行生根培養(yǎng)，每隔1周更換1次自來水.水培2周后，在每盆中注入6 L的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)1周.在觀察到旱柳長勢一致后，設置4個處理組，每組處理設置3個重復.在每個培養(yǎng)盆中加入等體積（6 L）的蒸餾水，再分別加入不同量的Cd（NO3）2和CaCl2溶液，使其濃度分別為0、50 mmol/L Ca、50μmol/L Cd、50 mmol/L Ca+50μmol/L Cd.用氣泵持續(xù)通氣，每天觀察旱柳生長情況，定期換水，處理7、14、21、28 d后對各處理組旱柳進行取材和實驗.

1.2.2 旱柳各器官中Cd、Fe、Mn含量的測定

在每個時間間隔（7、14、21和28 d）從每個處理組中分別取根、莖和葉.去除壞死組織和腐爛組織后，用流水徹底清洗15 min，再用蒸餾水沖洗3次，之后用ddH2O清洗旱柳各器官表面附著的Cd和Ca離子.將根、莖和葉分別放置在培養(yǎng)皿中，樣品在45℃下干燥3 d，在80℃下干燥1 d，在105℃下于烘箱中干燥12 h至恒重.每個樣品用萬分之一天平稱取0.200 0 g，放置在干凈燒杯中，加入5 mL濃硝酸，將燒杯放至電熱板上150℃下進行濕法消化.待樣品消化變白，冷卻后加入2 mL高氯酸，繼續(xù)加熱至樣品完全變干.進行消解后的樣品用10%的稀硝酸溶解，轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中定容.每個樣品重復3次.用原子吸收光譜儀（Analyst 400，美國PerkinElmer公司）測定根、莖、葉中Cd、Fe、Mn的含量.

1.2.3 旱柳根和葉亞細胞中Cd含量的測定

在處理7 d和28 d后分別取單一Cd處理組和Cd+Ca處理組中的旱柳葉片和根系，用ddH2O將樣品沖洗干凈并吸干表面水分.用天平準確稱量待測樣品4.000 g，加入20 mL組分提取液，在冰上充分研磨直至勻漿，然后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中離心（2 000 r/min，10 min），每個處理進行3次重復.離心后分離出上清液，下層沉淀為細胞壁及破碎殘渣部分.將離心提取到的上清合并后在4 000 r/min下離心15 min，再次分離出上清，上清液即為可溶性組分，所得沉淀為細胞核和葉綠體組分.以上操作均于4℃條件下進行.用濕法消化各亞細胞組分，用10%的稀硝酸定容于10 mL容量瓶，用原子吸收光譜儀測定各組分的Cd含量.

1.2.4 旱柳根、葉中Cd的化學形態(tài)分析

在處理7 d和28 d后分別取單一Cd處理組和Cd+Ca處理組中的旱柳葉片和根系，樣品沖洗干凈并吸干表面水分.準確稱量2.000 g樣品于研缽中，加入20 mL提取劑，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移入50 mL離心管中連續(xù)浸提，于25℃恒溫震蕩22 h，5 000 r/min離心10 min，倒出上清液.再在離心管中加入10 mL提取劑，25℃恒溫震蕩1 h，5 000 r/min離心10 min，將2次上清合并.每個處理進行3次重復.依次采用5種提取劑逐步提取重金屬Cd：①80%乙醇，主要是提取硝酸鹽、氯化物為主的無機鹽以及醇溶性蛋白質(zhì)、氨基酸鹽為主要形態(tài)的Cd（CdE）；②ddH2O，主要提取水溶性的有機酸鹽類的Cd（CdW）；③1 mol/L NaCl溶液，主要提取果膠酸鹽態(tài)、與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或吸附態(tài)的Cd（CdNaCl）；④2%醋酸，主要提取難溶于水的磷酸鹽類Cd（CdHAC）；⑤0.6 mmol/L鹽酸，主要提取草酸鹽類Cd（CdHCl）；⑥其余為殘留態(tài)Cd（CdR）.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SigmaPlot 12.5軟件處理所有數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Ca對旱柳各器官中Cd的積累和分布的影響

添加外源Ca后，隨著處理時間的延長，旱柳各器官內(nèi)Cd的積累與分布情況如表1所示.

表1 不同處理組中旱柳各器官內(nèi)的Cd含量Tab.1 Cd contents in different organs of S.matsudana in different treatment groups μg/g

由表1可以看出，與對照組相比，Cd處理組中旱柳各器官內(nèi)的Cd含量均隨處理時間的延長而增加，Cd含量表現(xiàn)為根＞莖＞葉.將Cd處理組與Cd+Ca處理組進行對比，發(fā)現(xiàn)在整個實驗周期內(nèi)Cd+Ca處理組中旱柳各器官內(nèi)的Cd含量均顯著低于Cd處理組中的含量（P＜0.05）.這些結(jié)果表明，添加外源Ca能夠降低Cd脅迫下旱柳各器官的Cd含量.

2.2 外源Ca對旱柳各器官中Fe的積累和分布的影響

添加外源Ca后，隨著處理時間的延長，旱柳各器官內(nèi)Fe的積累與分布情況如表2所示.

表2 不同處理組中旱柳各器官內(nèi)的Fe含量Tab.2 Fe contents in different organs of S.matsudana in different treatment groups μg/g

由表2可以看出，在整個實驗周期內(nèi)，對照組中旱柳的Fe含量始終處于最低水平，且隨著處理時間延長，F(xiàn)e含量逐漸增加.外源Ca的添加提高了旱柳各器官對Fe的吸收與積累，Cd的添加也顯著增加了旱柳對Fe的積累，并隨著培養(yǎng)時間的延長，積累量逐漸增加.在Cd+Ca處理組中，旱柳各器官內(nèi)Fe的積累量始終處于最高水平，且與對照組和Cd處理組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）.這些結(jié)果表明：外源Ca對Cd脅迫下旱柳各器官內(nèi)Fe的吸收和積累在一定程度上有促進作用.

2.3 外源Ca對Cd脅迫下旱柳各器官中Mn的積累和分布的影響

添加外源Ca后，隨著處理時間的延長，旱柳各器官內(nèi)Mn的積累與分布情況如表3所示.由表3可以看出，隨著處理時間的延長，對照組中旱柳的Mn含量處于穩(wěn)定增長趨勢；Ca處理組中旱柳各器官內(nèi)Mn的含量始終顯著高于對照組中的含量（P＜0.05），Cd處理組中旱柳各器官內(nèi)Mn的含量顯著低于對照組中的含量（P＜0.05），也顯著低于其他處理組中的含量（P＜0.05）；而Ca+Cd處理組中旱柳各器官內(nèi)Mn的含量顯著高于Cd處理組中的含量（P＜0.05）.這些結(jié)果表明，Cd對旱柳吸收積累Mn元素有一定的抑制作用，而外源Ca能夠緩解這種作用.

表3 不同處理組中旱柳各器官內(nèi)的Mn含量Tab.3 Mn contents in different organs of S.matsudana in different treatment groups μg/g

2.4 外源Ca對旱柳根系和葉片不同亞細胞組分Cd含量的影響

不同處理組中旱柳根系和葉片亞細胞組分的Cd含量如表4所示，Cd在各亞細胞組分中所占的比例如圖1所示.

表4 不同處理組中旱柳各亞細胞組分的Cd含量Tab.4 Subcellular Cd contents in the cells of S.matsudana in different treatment groups μg/g

圖1 不同處理組中旱柳根和葉內(nèi)不同亞細胞組分中Cd所占比例Fig.1 Percentage of Cd of different subcellular components in roots and leaves of S.matsudana in different treatment groups

由表4可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，根系各亞細胞組分的Cd含量顯著增加，不同亞細胞組分中Cd含量的排序為細胞壁＞可溶性組分＞細胞器.與Cd處理組相比，Cd+Ca處理組中根系各亞細胞組分的Cd含量均顯著降低（P＜0.05）.由圖1（a）可以看出，與Cd處理組相比，Cd+Ca處理組中根系可溶性組分Cd所占比例較高（P＜0.05），而細胞壁組分和細胞器組分的Cd所占比例較低（P＜0.05）.旱柳葉片中各亞細胞組分的Cd含量也隨著培養(yǎng)時間的延長顯著增加，不同亞細胞組分中Cd含量的排序為可溶性組分＞細胞壁＞細胞器.在處理7 d和28 d時，Cd處理組各亞細胞組分的Cd含量均顯著高于Cd+Ca處理組的含量（P＜0.05）.由圖1（b）可以看出，與Cd處理組相比，Cd+Ca處理組中可溶性組分的Cd所占比例較高（P＜0.05），而細胞壁組分和細胞器組分的Cd所占比例則較低（P＜0.05）.綜上所述，添加外源Ca后，旱柳根和葉片各亞細胞組分的Cd含量顯著降低（P＜0.05），且各亞細胞組分Cd所占比例出現(xiàn)了變化，即可溶性組分Cd所占比例增加，而細胞壁組分和細胞器組分Cd所占比例下降.

2.5 外源Ca對旱柳根和葉細胞內(nèi)Cd不同化學形態(tài)的影響

不同處理組中旱柳根、葉不同化學形態(tài)的Cd含量如表5所示.在整個實驗過程中，根系不同化學形態(tài)的Cd含量顯著高于葉片中的含量（P＜0.05）；在根和葉中NaCl提取態(tài)的Cd含量始終處于最高水平，醋酸和鹽酸提取態(tài)Cd含量次之，再次是水溶態(tài)Cd含量和乙醇提取態(tài)Cd含量，殘留態(tài)Cd含量始終處于最低水平.添加外源Ca后，Cd+Ca處理組中各化學形態(tài)的Cd含量均顯著低于Cd處理組的含量（P＜0.05），NaCl提取態(tài)Cd含量仍在各提取態(tài)之中占主要地位，醋酸和鹽酸提取態(tài)Cd含量次之.Ca對不同化學形態(tài)Cd的吸收抑制作用存在差異，不同處理組中根和葉不同化學形態(tài)的Cd所占比例如圖2所示.由圖2可以看出，不論是單一Cd處理組還是Ca+Cd處理組，根和葉片中的NaCl提取態(tài)Cd所占的比例均隨著培養(yǎng)時間的延長下降，醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)Cd的比例增加.同單一Cd處理組相比，添加外源Ca后，根和葉片中NaCl提取態(tài)Cd的比例增加，醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)Cd的比例降低.

表5 旱柳根系和葉片細胞內(nèi)不同化學形態(tài)的Cd含量Tab.5 Cd contents of different chemical forms in cells of root and leaves of S.matsudana μg/g

圖2 不同處理組旱柳根和葉中不同化學形態(tài)的Cd所占比例Fig.2 Percentage of Cd of different chemical forms in roots and leaves of S.matsudana in different treatment groups

3 討論與結(jié)論

Cd是生物毒性最強的重金屬元素之一[7]，遷移性很強，且極易被植物吸收并積累.Cd在植物體內(nèi)積累的量和存在部位因植物種類不同而存在差異.本研究發(fā)現(xiàn)在旱柳3種營養(yǎng)器官中Cd的積累水平為根＞莖＞葉，旱柳中Cd主要富集在根部，Cd脅迫下旱柳各個器官的Cd含量均隨培養(yǎng)時間的延長而升高.該結(jié)果與歐陽潔等[8]的研究結(jié)果一致.在外源Ca添加后，旱柳各器官的Cd含量均顯著降低，并且隨著處理時間的延長Ca對Cd吸收的抑制作用更加明顯.外源Ca能緩解Cd的毒害是因為Ca與Cd具有相似的化學性質(zhì)，當環(huán)境中同時存在Ca和Cd時，由于二者存在競爭關系，使得Ca可以顯著降低植物對Cd的吸收與積累，從而減輕Cd的毒害作用[9].Cd元素的存在會影響植物體對礦質(zhì)元素的攝取，引發(fā)體內(nèi)微量元素代謝失衡.本研究中旱柳對Cd的吸收積累影響了植物對Fe和Mn的吸收.Fe是植物體進行光合作用、生物固氮和呼吸作用中的細胞色素和非血紅素鐵蛋白的組成成分.本研究結(jié)果顯示，Cd脅迫下旱柳體內(nèi)Fe含量顯著增加，這可能與植物體內(nèi)的離子運輸機制有關.Kovács等[10]認為，F(xiàn)e離子可能與Cd離子競爭相同的植物細胞膜結(jié)合（運輸）位點，足夠的Fe離子供應會減輕植物對Cd的吸收，這可能是植物應對Cd脅迫做出的適應性反應.Cd脅迫能夠促進旱柳對Fe離子的吸收和積累，但會抑制對Mn的吸收和積累，這與孫盛等[11]對黃瓜幼苗的研究結(jié)果一致.Mn是植物體內(nèi)重要的礦物質(zhì)元素，在植物生長過程中起到重要作用.外源Ca的添加能夠顯著促進旱柳對Fe和Mn的吸收與積累.

植物細胞壁主要由半纖維素、纖維素、果膠以及蛋白質(zhì)等組成，纖維素和半纖維素是細胞壁中主要的結(jié)構性多糖，起到維持細胞形狀以及抗壓的作用[12].半纖維素中含有大量的羧基、羰基、巰基等官能團[13]，對Cd具有較強的絡合與螯合能力.旱柳根系中Cd的富集可能是因為Cd大量沉淀在細胞壁上，從而減弱了Cd對細胞器等生命活動核心組件物質(zhì)的毒害作用，是旱柳根系細胞緩解Cd毒害作用的解毒機制之一.Liu等[14]、Zare等[15]也指出，植物根系細胞壁對重金屬具有一定的沉積作用，是重金屬進入植物體的第一道屏障，也是重金屬的主要蓄積場所.在旱柳葉片細胞中可溶性組分的Cd含量始終最高，說明葉細胞中可溶性組分是Cd富集的主要部位.植物的可溶性組分由細胞質(zhì)和液泡組成，細胞質(zhì)是細胞進行新陳代謝的主要場所，而液泡的功能主要是參與細胞水分代謝，液泡中含有的多種蛋白質(zhì)、有機酸、有機堿等物質(zhì)都能與Cd結(jié)合[16]，即液泡區(qū)室化也是植物抵抗重金屬毒害和參與重金屬解毒的重要機理之一.與單一Cd處理相比，在外源Ca添加后旱柳葉細胞壁組分和細胞器組分中的Cd含量均下降，而可溶性組分中的Cd含量上升，說明添加Ca可能啟動了植物體內(nèi)的鈣信號，引發(fā)植物產(chǎn)生一系列的生物化學反應，液泡區(qū)室化承擔了更大的Cd解毒作用[17].

在旱柳根系和葉片中不同化學形態(tài)的Cd含量均表現(xiàn)出CdNaCl＞CdHAC＞CdHCl＞CdW＞CdE＞CdR，即Cd主要賦存的化學形態(tài)為NaCl提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)，水溶態(tài)、乙醇提取態(tài)和殘渣態(tài)含量較少.NaCl提取態(tài)的Cd占優(yōu)勢，這與游少鴻等[18]在香蒲中的研究結(jié)果一致.林曉燕等[19]研究發(fā)現(xiàn)NaCl提取態(tài)的Cd主要是能與蛋白質(zhì)結(jié)合的呈吸著態(tài)的Cd，這表明進入植物體內(nèi)的Cd多與一些螯合蛋白質(zhì)（如金屬硫蛋白、植物螯合肽等一些富含巰基的蛋白質(zhì)）相結(jié)合，這主要是因為這些蛋白質(zhì)中的巰基與Cd離子之間有很強的親和力.在外源Ca添加后，與單純Cd處理相比，NaCl提取態(tài)的Cd比例增加，而醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)Cd比例降低，這也表明添加外源Ca可能啟動了植物體內(nèi)的鈣信號，促進富含巰基蛋白的表達以及Cd與這些蛋白的結(jié)合，從而降低Cd對旱柳的毒害作用.

綜合上述結(jié)果，對Cd脅迫下的旱柳添加外源Ca，確實能夠通過降低各器官的Cd含量、調(diào)整各亞細胞組分Cd含量和Cd化學形態(tài)的方式，緩解環(huán)境中的Cd對旱柳的毒害作用.