何肖微，王司辰，趙大勇*

(1.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué) 水利工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇 南京 210098；3.河海大學(xué) 水利學(xué)科專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇 南京 210098)

浮游細(xì)菌是湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，并且在生源要素的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。淡水湖泊中的浮游細(xì)菌群落組成往往會(huì)隨時(shí)空因素而變化[1-5]。許多因素都可以影響淡水湖泊中的浮游細(xì)菌群落組成，如營(yíng)養(yǎng)鹽、鹽度、溶解性有機(jī)碳、生產(chǎn)力和水溫等[2,6-7]。此外，已有的關(guān)于大型淺淡水湖泊中浮游細(xì)菌群落組成的研究結(jié)果表明：水生植物的存在或缺失會(huì)導(dǎo)致浮游細(xì)菌群落組成發(fā)生顯著變化[5]。這說(shuō)明包括水生植物在內(nèi)的許多因素導(dǎo)致的生境異質(zhì)會(huì)影響湖泊的浮游細(xì)菌群落組成[8]。

水生植物是淡水湖泊中的重要初級(jí)生產(chǎn)力，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性有重要影響[9-10]。在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，水生植物為微生物提供了多種微生境，并通過(guò)為它們提供必要的基質(zhì)來(lái)影響浮游細(xì)菌的豐度和活性[11-13]。研究[14]表明：水生植物釋放的化合物可以作為直接改變浮游細(xì)菌群落的選擇性因子。綜合這些研究結(jié)果可形成如下科學(xué)假設(shè)，即水生植物可能驅(qū)動(dòng)湖泊中的浮游細(xì)菌群落變化。

目前，關(guān)于水生植物對(duì)湖泊浮游細(xì)菌群落影響的研究還比較少。作者從南京花神湖采集2種常見(jiàn)水生植物：沉水植物苦草(Vallisnerianatans)和飄浮植物浮萍(Lemnaminor)；構(gòu)建包含植物的微宇宙模擬體系，在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)采集水樣，對(duì)其理化指標(biāo)和浮游細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，對(duì)比不同處理組浮游細(xì)菌群落多樣性及組成的差異，探討水生植物對(duì)湖泊浮游細(xì)菌群落的影響，以期為豐富湖泊微生物生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)理論提供參考數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品采集

在南京花神湖使用彼得遜采泥器采集沉積物樣品，并收集足量的湖水、苦草和浮萍幼苗，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用于構(gòu)建微宇宙模擬體系。將采集的沉積物混勻、過(guò)篩(100目)后均勻分裝到直徑20 cm、高度50 cm的圓柱狀有機(jī)玻璃微宇宙模擬體系中，沉積物深度為10 cm左右。依次向微宇宙模擬體系中加入采集的花神湖湖水(高度約10 cm)和滅菌純凈水(高度約30 cm)。待體系穩(wěn)定3 d后，挑選完整、健康的水生植物苦草和浮萍進(jìn)行移植，移植前用過(guò)氧乙酸對(duì)苦草和浮萍幼苗葉片等部位進(jìn)行滅菌處理，以只包含花神湖湖水和沉積物、未移植水生植物為空白對(duì)照，3種體系各設(shè)置1個(gè)重復(fù)組。待植物生長(zhǎng)穩(wěn)定后，將其中一組模擬體系設(shè)置為添加氨氮處理組，每4 d向其中添加2 mg·L-1的氨氮。分別在模擬體系培養(yǎng)穩(wěn)定后的第14 d、第35 d和第70 d采集不同體系中的水樣并儲(chǔ)存在無(wú)菌聚丙乙烯瓶中，用于提取DNA和理化指標(biāo)測(cè)定。

1.2 理化指標(biāo)測(cè)定方法

1.3 DNA提取和測(cè)序

使用0.22 μm聚碳酸酯濾膜(Millipore,Billerica,MA,USA)過(guò)濾水樣，參照試劑盒Water DNA Kit(OMEGA bio-tek)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL的PCR反應(yīng)體系包含：10 μL的5×Prime STAR Buffer(plus Mg2+)、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.4 μmol·L-1上下游引物、2.0 U TaKaRa Taq DNA聚合酶，加ddH2O到50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸7 min。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，然后充分混合。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，在羅氏454 FLX Titanium平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。所有的原始測(cè)序結(jié)果文件均已上傳至美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索號(hào)為SRP091979。

1.4 高通量測(cè)序序列處理

依據(jù)Mothur軟件包的SOP流程(https://mothur.org/wiki/454_sop/)對(duì)高通量測(cè)序序列進(jìn)行預(yù)處理。首先，將下機(jī)原始測(cè)序文件進(jìn)行降噪和修剪處理，刪除測(cè)序質(zhì)量較低的序列(平均質(zhì)量<27)和較短的序列(<200 bp，不包括引物和barcode)，并刪除單一堿基連續(xù)出現(xiàn)8次以上的序列。使用NAST算法將剩余序列與SILVA 16S rRNA基因模板進(jìn)行對(duì)齊。為了加速后續(xù)計(jì)算過(guò)程，使用 ‘pre.cluster’命令進(jìn)一步精簡(jiǎn)數(shù)據(jù)，然后使用 ‘chimera.uchime’ 命令去除嵌合體序列。使用RDP在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)，應(yīng)用基于80%的cutoff閾值獲得細(xì)菌群落分類學(xué)信息。使用最大鄰近距離法在基于3%的差異值水平上劃分操作分類單元(OTU)。按照全部樣品中獲得的最小序列數(shù)進(jìn)行序列隨機(jī)抽取采樣，使得文庫(kù)中各個(gè)樣品的序列數(shù)一致，以方便進(jìn)行α和β多樣性指數(shù)的計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Mothur軟件包的‘summary.single’命令計(jì)算細(xì)菌群落的豐度(OTU數(shù))和多樣性指數(shù)(Chao1)。運(yùn)用R軟件中的‘vegan’包計(jì)算兩兩細(xì)菌群落之間的β多樣性(基于Bray-Curtis距離)，使用非度量多維尺度分析(NMDS)進(jìn)行可視化，使用典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)評(píng)價(jià)環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落組成的影響。使用‘a(chǎn)donis’命令進(jìn)行非參數(shù)多元方差分析(PerMANOVA)，判斷采樣時(shí)間和添加氨氮兩因素對(duì)浮游細(xì)菌群落影響的大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 浮游細(xì)菌群落分類學(xué)分析

基于80%的cutoff閾值，對(duì)浮游細(xì)菌群落中各序列的分類學(xué)信息進(jìn)行分析，并計(jì)算不同處理組中浮游細(xì)菌群落各個(gè)門所占的相對(duì)豐度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同處理組中浮游細(xì)菌群落門類相對(duì)豐度柱狀圖(“+”代表添加氨氮處理組)Fig.1 Relative abundance of bacterioplankton community at phylum level in different treatment groups(“+”reprents ammonia-nitrogen addition treatment group)

由圖1可知：變形菌門(Proteobacteria)在所有處理組中的平均相對(duì)豐度最高，達(dá)到(47.00±19.22)%，其包含的3個(gè)綱α-變形菌綱(α-Proteobacteria)、β-變形菌綱(β-Proteobacteria)和γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)的相對(duì)豐度在各個(gè)處理組中都較高，平均豐度分別達(dá)到了(17.30±12.11)%、(23.80±17.12)%和(5.20±6.21)%；放線菌門(Actinobacteria)(16.30±16.48)%、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)(10.70±13.37)%和擬桿菌門(Bacteroidetes)(10.10±7.48)%也是本次發(fā)現(xiàn)的浮游細(xì)菌群落中的主要優(yōu)勢(shì)類群；β-Proteobacteria在第14 d的所有處理組中的相對(duì)豐度均較高；放線菌門在第35 d和第70 d的空白處理組中的相對(duì)豐度較高；綠菌門(Chlorobi)在第14 d的浮萍處理組中的相對(duì)豐度較高；藍(lán)藻門在第70 d的浮萍處理組中的相對(duì)豐度較高。研究[15-17]發(fā)現(xiàn)：變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門和疣微菌門是湖泊水體浮游細(xì)菌群落中的常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)類群，本研究發(fā)現(xiàn)的湖泊浮游細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群與上述研究基本一致。此外，湖泊的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和溫度等環(huán)境因子也會(huì)對(duì)浮游細(xì)菌群落組成有較大影響[18]。

由于在門的分類學(xué)水平上無(wú)法了解具體浮游細(xì)菌種屬的相對(duì)豐度變化情況，因此，進(jìn)一步篩選出每個(gè)處理組中平均相對(duì)豐度最高的10個(gè)屬，比較它們?cè)诓煌幚斫M中的相對(duì)豐度差異，以熱圖的形式來(lái)呈現(xiàn)，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：(1)擬桿菌門中的Sediminibacterium屬、Fluviicola屬以及Flavobacterium屬在第14 d處理組中的相對(duì)豐度較高(>1%)，但在第35 d處理組中的相對(duì)豐度很低(<1%)。有研究[16,19]顯示，擬桿菌豐度與水生植物生物量成正比關(guān)系，水生植物可以通過(guò)改善水質(zhì)以及釋放分泌物來(lái)影響浮游細(xì)菌群落組成。(2)變形菌門中的LD28_freshwater_group、Methylophilus屬和Methylotenera屬在第14 d苦草處理組中的相對(duì)豐度較高(>1%)，變形菌門中的Novosphingobium屬和Legionella屬在第35 d苦草處理組中的相對(duì)豐度較高(>1%)，變形菌門中的Sphingomonas屬在第35 d空白處理組中的相對(duì)豐度較高(>1%)。有研究[20]顯示，變形菌門在低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中更易獲取營(yíng)養(yǎng)，成為優(yōu)勢(shì)類群。

圖2 不同處理組中優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度熱圖(“+”代表添加氨氮處理組)Fig.2 Relative abundance of dominant bacterioplankton at genus level in different treatment groups(“+”reprents ammonia-nitrogen addition treatment group)

2.2 浮游細(xì)菌群落組成分析

為了比較不同處理組中浮游細(xì)菌群落的組成差異，通過(guò)非度量多維尺度分析比較苦草、浮萍和空白組不同采樣時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌群落組成差異，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同處理組中浮游細(xì)菌群落組成差異Fig.3 Differences of bacterioplankton community composition in different treatment groups

由圖3可知：第14 d時(shí)的浮游細(xì)菌樣品趨向于聚類在一起，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)初期浮游細(xì)菌群落組成較為相似；第35 d和第70 d時(shí)的浮游細(xì)菌樣品聚類程度不如第14 d時(shí)的緊密，且同一種水生植物處理組的樣品呈現(xiàn)聚集。這可能是由于水生植物在實(shí)驗(yàn)中后期對(duì)水體浮游細(xì)菌群落影響作用增強(qiáng)而導(dǎo)致的。

為了探究采樣時(shí)間和添加氨氮兩因素對(duì)水體浮游細(xì)菌群落影響作用的大小，通過(guò)非參數(shù)多元方差分析對(duì)比兩因素對(duì)水體浮游細(xì)菌群落影響作用的大小，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 采樣時(shí)間和添加氨氮兩因素對(duì)水體浮游細(xì)菌群落影響作用的比較

由表1可知：采樣時(shí)間對(duì)水體浮游細(xì)菌群落具有顯著影響(P<0.01)，而添加氨氮對(duì)水體浮游細(xì)菌群落無(wú)顯著影響(P>0.05)。氨氮作為重要的營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)湖泊水生植物和浮游細(xì)菌群落都會(huì)產(chǎn)生影響。但是，本研究中的微宇宙模擬體系中存在沉積物和水生植物，這兩者都會(huì)迅速吸收添加入系統(tǒng)的氨氮，從而使得添加氨氮處理組與對(duì)照組中水體氨氮濃度無(wú)太大差異。

2.3 浮游細(xì)菌群落的豐度和多樣性分析

經(jīng)過(guò)降噪、去除嵌合體以及非細(xì)菌序列之后，獲得的單個(gè)樣品的序列數(shù)在3 170～5 614之間。依據(jù)最少序列數(shù)3 170進(jìn)行隨機(jī)重采樣，以此計(jì)算出各個(gè)浮游細(xì)菌群落樣品的豐度和多樣性指數(shù)。根據(jù)表1中的結(jié)果，添加氨氮對(duì)水體浮游細(xì)菌群落無(wú)顯著影響。因此，在分析浮游細(xì)菌群落的豐度和多樣性指數(shù)時(shí)，將有無(wú)氨氮添加的兩組樣品合并后進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：在第14 d浮游細(xì)菌樣品中，浮萍處理組浮游細(xì)菌群落的豐度(OTU數(shù))和多樣性指數(shù)(Chao1)比苦草處理組和空白處理組都要高；隨后，各個(gè)處理組樣品中的浮游細(xì)菌群落的豐度和多樣性指數(shù)均開(kāi)始下降，但浮萍處理組樣品中浮游細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)一直比另外兩個(gè)處理組要高；在第70 d時(shí)，苦草處理組浮游細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)出現(xiàn)回升，兩個(gè)水生植物處理組中浮游細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)接近一致。這反映了不同水生植物對(duì)浮游細(xì)菌群落多樣性的影響機(jī)制不同。培養(yǎng)初期，浮萍處理組浮游細(xì)菌大量繁殖，浮萍生長(zhǎng)消耗水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，葉片也能為浮游細(xì)菌提供定殖的場(chǎng)所；隨著時(shí)間推移，浮萍生長(zhǎng)改變了水體的pH值和溶解氧等環(huán)境因子，不同細(xì)菌類群對(duì)pH值的響應(yīng)不同，水體pH值的改變也是影響浮游細(xì)菌群落變化的重要因素[21-23]。而苦草屬于沉水植物，生長(zhǎng)初期主要吸收沉積物中的營(yíng)養(yǎng)鹽，與浮游細(xì)菌的生態(tài)位不重合，這也能合理解釋苦草處理組與空白處理組體系前中期(14 d和35 d)的浮游細(xì)菌群落多樣性相似[10]。兩個(gè)水生植物處理組在第70 d呈現(xiàn)出相似的多樣性水平，均略高于空白處理組，說(shuō)明經(jīng)過(guò)70 d的培養(yǎng)，兩個(gè)水生植物體系趨于穩(wěn)定，并為浮游細(xì)菌提供了一定的生態(tài)位，增加了浮游細(xì)菌群落的多樣性。此外，水生植物與浮游藻類間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系以及水生植物的化感作用等也能間接影響浮游細(xì)菌群落多樣性的變化[24]。

圖4 不同處理組浮游細(xì)菌群落豐度和多樣性指數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.4 Variations of abundance and diversity index of bacterioplankton community with time in different treatment groups

2.4 環(huán)境因子對(duì)浮游細(xì)菌群落組成的影響分析

為了探究微宇宙模擬體系中水質(zhì)因子的變化對(duì)浮游細(xì)菌群落組成的影響，測(cè)定了每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)體系中的主要水質(zhì)因子，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同采樣時(shí)間點(diǎn)各處理組中的主要水質(zhì)因子/(mg·L-1)

應(yīng)用典型對(duì)應(yīng)分析探究水質(zhì)因子的變化對(duì)浮游細(xì)菌群落組成的影響，并通過(guò)排序圖進(jìn)行呈現(xiàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同處理組中浮游細(xì)菌群落與環(huán)境因子的典范對(duì)應(yīng)分析圖Fig.5 Canonical correspondence analysis of bacterioplankton community and environmental factors in different treatment groups

由圖5可知，總體上，不同時(shí)間序列處理組(第14 d、第35 d和第70 d)的細(xì)菌群落分別聚類在一起。觀察樣品在沿兩個(gè)軸方向的分布上，可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)初期的第14 d處理組的細(xì)菌群落沿CCA1軸分布，隨后的第35 d和第70 d處理組的細(xì)菌群落大致沿CCA2軸分布，呈現(xiàn)出明顯的隨時(shí)間演替規(guī)律，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)初期與實(shí)驗(yàn)中后期的浮游細(xì)菌群落整體上受不同環(huán)境因子的影響。

進(jìn)一步應(yīng)用envfit函數(shù)對(duì)環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：氨氮、總磷和總有機(jī)碳是影響水體中浮游細(xì)菌群落組成的主要環(huán)境因子(表3)。一方面，氮和磷會(huì)增加異養(yǎng)細(xì)菌的生物量并導(dǎo)致其群落組成的變化[25]。另一方面，水體中氮、磷的變化也能通過(guò)影響浮游植物群落組成而間接影響浮游細(xì)菌群落。薛銀剛等[26]在太湖竺山灣的研究顯示，總磷含量顯著影響了浮游細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)。

表3 環(huán)境因子與排序軸之間的相關(guān)性

3 結(jié)論

構(gòu)建了包含淡水湖泊中兩種典型水生植物苦草(Vallisnerianatans)和浮萍(Lemnaminor)的微宇宙模擬體系，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，探討了水生植物對(duì)湖泊浮游細(xì)菌群落組成的影響。結(jié)果表明：不同采樣時(shí)間及處理組中，浮游細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)類群不同；氨氮的加入對(duì)浮游細(xì)菌群落的影響沒(méi)有采樣時(shí)間大；實(shí)驗(yàn)初期，浮萍處理組的浮游細(xì)菌群落多樣性指數(shù)比苦草和空白處理組都要高，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各個(gè)處理組的浮游細(xì)菌群落多樣性指數(shù)總體開(kāi)始下降并最終趨于一致；氨氮、總磷和總有機(jī)碳是影響浮游細(xì)菌群落組成的主要環(huán)境因子。