薛 也，王 艷,，趙 寧，竇博鑫，辛嘉英,2，韓 燁

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000）

Cu2+在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上有廣泛應(yīng)用[1]，常被用作保鮮劑、保色劑、殺菌劑，有防止果蔬變質(zhì)、保持農(nóng)作物顏色以及殺菌的作用，并且Cu2+也是人體內(nèi)必不可缺少的微量元素，攝入過(guò)多或缺乏都會(huì)危害健康[2-3]。因此，Cu2+是食品分析及食品安全檢測(cè)中的重要指標(biāo)[4-6]。

Cu2+常用檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、熒光光譜法等，但這些方法都存在著耗時(shí)較長(zhǎng)、需要專業(yè)操作人員、不利于實(shí)際應(yīng)用等問(wèn)題[7-12]。近幾年隨著電化學(xué)技術(shù)的不斷完善，其靈敏度高、制作簡(jiǎn)易、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[13]，常被用于重金屬檢測(cè)工作中。Peng Donglai等[14]研制了羅丹明B肼修飾納米金的電化學(xué)傳感器，并將其應(yīng)用于檢測(cè)水中Cu2+，檢出限為12.5 μmol/L。Kaur等[15]合成了螯合型二硫醇并將其自組裝到金電極表面，形成能夠吸附金屬離子的大環(huán)，用于檢測(cè)Cu2+，線性范圍為1.0×10－12～1.0×10－5mol/L（r2=0.990），檢出限可達(dá)到9.7×10－13mol/L。朱浩嘉等[16]利用同位鍍汞陽(yáng)極溶出伏安法對(duì)牛奶樣品中Cd2+、Pb2+和Cu2+元素含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，其中Cu2+的線性范圍為0.5～100 μg/L，檢出限為0.1 μg/L。

甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb），是一種由甲烷氧化菌（Methylosinus trichosporiumOB3b）產(chǎn)生的具有極高銅親和力的蛋白活性肽，在Mb結(jié)構(gòu)中含有2 個(gè)4-亞硫酰-5-羥基咪唑基團(tuán)，通過(guò)2 個(gè)咪唑N、2 個(gè)硫酰S與銅絡(luò)合，能特異性捕獲環(huán)境中的銅，對(duì)Cu2+具有較強(qiáng)的專一性[17-18]。納米金（gold nanoparticles，AuNPs）具有較大的表面積、好的生物相容性和表面等離子體增強(qiáng)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，可以在局部形成增強(qiáng)的電磁場(chǎng)，吸附生物大分子，常用于電化學(xué)實(shí)驗(yàn)[19-21]。由于AuNPs表面容易功能化，易與生物分子相互結(jié)合，通過(guò)在檸檬酸鈉還原法合成的AuNPs（粒徑16 nm）中引入Mb，可使Mb的生物活性被賦予在AuNPs上，有利于生物分子的穩(wěn)定結(jié)合，增強(qiáng)特異性結(jié)合，顆粒分散均勻，可以抑制納米顆粒的團(tuán)聚[22-23]（圖1A）。因此本實(shí)驗(yàn)借助AuNPs與裸金電子之間的強(qiáng)吸附特性、Mb中L-半胱氨酸巰基與AuNPs通過(guò)金硫鍵鍵合的特性，制備Mb-AuNPs修飾電極（圖1B），通過(guò)Mb對(duì)Cu2+特異性捕捉的作用（圖1C），利用溶出伏安法檢測(cè)Cu2+具有檢出限低、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的優(yōu)勢(shì)。

圖1 Mb-AuNPs修飾電極檢測(cè)原理圖Fig.1 Schematic diagram of copper ion detection with Mb-AuNP-modified electrode

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲基彎菌IMV 3011 俄羅斯科學(xué)院催化研究所；無(wú)水乙醇 天津富宇精細(xì)化工有限公司；氯金酸、CuSO4、PbCl2、HgCl2、Ag(NO3)2、FeCl3、CrO3、CuCl國(guó)藥集團(tuán)上海試劑有限公司；檸檬酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計(jì) 賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司；生化發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程公司；CHI630電化學(xué)工作站、金盤電極、鉑絲電極、Ag/AgCl電極（3 mol/L KCl溶液） 上海辰華儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 Mb-AuNPs修飾電極的制備

參照文獻(xiàn)[24-25]，對(duì)甲烷氧化菌進(jìn)行培養(yǎng)并提取Mb（1×10－4mol/L），制備Mb-AuNPs；本實(shí)驗(yàn)使用固體三電極體系（工作電極：金電極；參比電極：Ag/AgCl；對(duì)電極：Pt電極），參考文獻(xiàn)[26-27]的方式稍作調(diào)整對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理。配制食人魚(yú)溶液（濃硫酸-過(guò)氧化氫（7∶3，V/V）），將金電極泡制在其中8 min后，用去離子水洗凈；在0.3、0.1、0.05 μm氧化鋁粉末上拋光后，分別用無(wú)水乙醇和二次蒸餾水在超聲中清洗各3 min；吹干后，在0.5 mol/L H2SO4溶液中循環(huán)伏安法掃描15 圈進(jìn)行活化。將電極浸泡在已配制好的pH 6.5的Mb-AuNPs中8 h，4 ℃避光保存，制得Mb-AuNPs修飾電極。

1.3.2 溶出伏安法檢測(cè)Cu2+

取出已經(jīng)修飾好的金電極，去離子水沖洗20 s后吹干，吸附待測(cè)濃度的Cu2+溶液50 min，同1.3.1節(jié)沖洗吹干，隨后利用溶出伏安法在0.05 mol/L且pH 5.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中進(jìn)行檢測(cè)，電沉積時(shí)間40 s，頻率10 Hz，振幅25 mV。

1.3.3 干擾程度計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 金電極活化

如圖2所示，經(jīng)過(guò)硫酸活化后，其還原峰增加，且有多重氧化峰的出現(xiàn)，說(shuō)明金電極的靈敏度增加，有助于Mb-AuNPs充分修飾電極。

圖2 金電極硫酸活化前后對(duì)比圖Fig.2 Effect of H2SO4 activation on electrode sensitivity

2.2 電極一致性的檢測(cè)

為保證實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)且因?qū)嶒?yàn)所使用的金電極數(shù)量多，對(duì)預(yù)處理后的電極進(jìn)行一致性考察[24]。如圖3所示，6 根電極掃描出的曲線重合性較好，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)時(shí)金電極基本一致。

圖3 金電極的一致性考察Fig.3 Consistency of electrodes

2.3 Mb-AuNPs修飾電極的表征

如圖4所示，Mb-AuNPs修飾電極較空白電極相比，多出2 個(gè)還原峰，－0.7 V處的峰所代表的是金硫鍵的特征峰，Mb與納米金完全結(jié)合可能是導(dǎo)致其峰形較小的原因。－1.1 V處峰代表的可能是Mb-AuNPs的擴(kuò)散特性[21]，由此判斷，Mb-AuNPs已修飾在電極表面[26,28]。

圖4 Mb-AuNPs修飾電極表征圖Fig.4 Characterization of Mb-AuNP-modified electrode

2.4 溶出伏安法檢測(cè)Cu2+

2.4.1 Mb-AuNPs修飾電極時(shí)間的影響

已處理好且一致性良好的電極分別在Mb-AuNPs溶液中浸泡2、4、6、8、10、12 h后，對(duì)100 nmol/L的Cu2+待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)。如圖5所示，檢測(cè)的Cu2+峰電流值與金電極在Mb-AuNPs溶液的浸泡時(shí)間呈一定相關(guān)性。金電極浸泡在功能化納米金復(fù)合物溶液中時(shí)長(zhǎng)為8 h時(shí)，Cu2+檢測(cè)的電信號(hào)強(qiáng)度最大。當(dāng)浸泡時(shí)間從2 h增加到8 h時(shí)，峰值電流不斷增大。8 h后再繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，峰值電流減小。這說(shuō)明當(dāng)浸泡時(shí)間為8 h時(shí)，電極上的Mb-AuNPs已接近飽和狀態(tài)。

圖5 Mb-AuNPs修飾時(shí)間對(duì)檢測(cè)Cu2＋的影響Fig.5 Effect of Mb-AuNP modification time on the detection of copper ions

2.4.2 Cu2+吸附時(shí)間的影響

在檢測(cè)Cu2+前，需要將Cu2+吸附在已修飾好的電極上，即將已修飾好的Mb-AuNPs電極浸泡在Cu2+溶液中。如圖6所示，吸附時(shí)間在10～50 min時(shí)，峰電流值隨著吸附Cu2+溶液時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這說(shuō)明吸附時(shí)間越長(zhǎng)，與Mb-AuNPs作用的Cu2+量就越多，即Cu2+在電極表面的吸附量就越大，檢測(cè)到的信號(hào)就越強(qiáng)，溶出峰電流值越高。吸附時(shí)間在50 min之后，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，Cu2+的峰電流值減小，這可能是由于Mb-AuNPs和Cu2+之間的鍵合作用雖然較強(qiáng)，但隨著吸附溶液時(shí)間延長(zhǎng)，部分Cu2+脫落，斷開(kāi)了與Mb-AuNPs的連接，最終檢測(cè)出的峰電流值減小。

圖6 Mb-AuNPs修飾電極吸附Cu2＋時(shí)間對(duì)檢測(cè)的影響Fig.6 Effect of adsorption time of Cu2+ onto Mb-AuNP-modified electrode on detection efficiency

2.4.3 電沉積時(shí)間的影響

如圖7所示，10～40 s的峰電流值逐漸增長(zhǎng)，這可能是由于沉積時(shí)間比較短，Cu2+在電極表面沉積還原的量小于富集的量，因此電信號(hào)呈現(xiàn)出隨沉積時(shí)間延長(zhǎng)而增大的趨勢(shì)。在40 s時(shí)，沉積時(shí)間使Mb-AuNPs配位的Cu2+全部還原。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可能是電極表面的Mb-AuNPs部分脫落，從而導(dǎo)致電信號(hào)降低。綜上，沉積時(shí)間選擇40 s。

圖7 沉積時(shí)間對(duì)Mb-AuNPs修飾電極檢測(cè)Cu2＋的影響Fig.7 Effect of deposition time on detection efficiencyof copper ions

2.4.4 PBS pH值的影響

如圖8所示，在pH 4.5～5.5時(shí)，隨著pH值的增加，峰電流增大。pH值大于5.5時(shí)，峰電流減小可能是由于隨著pH值升高，Mb-AuNPs與Cu2+的相互作用減弱，Cu2+脫落。故選擇pH值為5.5的PBS作為檢測(cè)條件。

圖8 pH值對(duì)Mb-AuNPs修飾電極檢測(cè)Cu2＋的影響Fig.8 Effect of pH on detection efficiency of copper ions

2.5 線性關(guān)系與檢出限

采用方波溶出伏安法，利用Mb-AuNPs修飾電極對(duì)不同濃度Cu2+進(jìn)行檢測(cè)。由圖9可知，隨著Cu2+濃度的增加，其溶出峰也在升高。以lgc為橫坐標(biāo)（c為Cu2+濃度），相應(yīng)的峰電流（μA）為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，峰電流值與Cu2+濃度的對(duì)數(shù)呈一定線性相關(guān)。通過(guò)線性擬合在10 nmol/L～100 μmol/L范圍內(nèi)的9 種Cu2+濃度的對(duì)應(yīng)峰電流值回歸方程為：I=0.385 44lgc+2.007 53（R2=0.960 09，n=6）說(shuō)明線性關(guān)系良好。經(jīng)計(jì)算，檢出限為1.15 nmol/L。

圖9 方波溶出伏安法檢測(cè)Cu2＋Fig.9 Detection of copper ions by square wave soluble voltammetry

2.6 干擾離子檢測(cè)

在100 nmol/L的待測(cè)溶液中加入10 倍其他離子，分別是Pb2+、Hg2+、Ag2+、Fe3+、Cr6+、Ni2+、Al3+、Zn2+、Cu+，對(duì)檢測(cè)體系的特異性進(jìn)行測(cè)定，每組測(cè)定5 次，結(jié)果如表1所示，各離子對(duì)檢測(cè)Cu2+時(shí)的干擾程度均小于2%，可忽略不計(jì)。因此Cu2+的檢測(cè)濃度在10 nmol/L～100 μmol/L時(shí)，不受其他離子的干擾，由此可以證明Mb對(duì)捕捉Cu2+具有較強(qiáng)的專一性[17,22]。

表1 其他離子對(duì)檢測(cè)的影響Table 1 Interfering effects of coexisting ions on Cu2+ detection

2.7 重復(fù)性與穩(wěn)定性

為了檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和電極的穩(wěn)定性，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。在PBS里對(duì)檢測(cè)Cu2+的電極連續(xù)10 次掃描，平行測(cè)定5 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.9%。將制備好的修飾電極保存于4 ℃冰箱中，分別存放2、4、6、8、10、12、14 d后取出對(duì)Cu2+檢測(cè)，重復(fù)5 次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，在第14天對(duì)Cu2+的響應(yīng)電流強(qiáng)度達(dá)到84.24%，表明該修飾電極穩(wěn)定性良好。

表2 Mb-AuNPs修飾電極Cu2＋檢測(cè)穩(wěn)定性Table 2Stability of Mb-AuNP-modified electrode for detection of copper ions

3 結(jié) 論

用Mb-AuNPs修飾金電極建立了檢測(cè)Cu2+的新方法，金電極修飾時(shí)間8 h、檢測(cè)時(shí)間50 min、電沉積40 s、PBS（pH 5.5）的溶出伏安法對(duì)Cu2+檢測(cè)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，檢出限可達(dá)到1.15 nmol/L，均低于文獻(xiàn)報(bào)道[17,23,29-30]，說(shuō)明敏感性好。10 倍濃度的9 種其他金屬離子的干擾實(shí)驗(yàn)均顯示對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響，說(shuō)明特異性好。通過(guò)重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，表明此Mb-AuNPs修飾電極檢測(cè)Cu2+準(zhǔn)確性高且穩(wěn)定性良好。因此，本方法對(duì)運(yùn)用在食品中進(jìn)行痕量的Cu2+檢測(cè)具有參考應(yīng)用價(jià)值。