咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚在金柑防腐保鮮貯藏中的殘留動態(tài)及風險評估

蘇德森，鄭云云，陳自強，吳建衍，黃崇耀

（福建省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，福建省農產品質量安全重點實驗室，福建 福州 350003）

金柑，別名金橘，皮嫩脆，具有油脂清香刺激性特殊氣味，富含VC、胡蘿卜素，深受人們喜愛[1-3]。適當攝取金柑，對防治咽喉腫痛、咳痰、胸悶腹脹等身體不適癥狀具有良好的效果[4-5]。然而，由于金柑皮薄、水分高，因此不易保存。最常用、最經濟的保鮮方式需要使用化學試劑[6-8]。

咪鮮胺又稱撲霉靈、丙滅菌、施保克，是咪唑類廣譜農藥殺菌劑，其抑制麥角甾醇的生物合成，對多種作物子囊菌和半知菌病害的防效顯著，其可防治稻瘟病、葉斑病、赤霉病、炭疽病、褐斑病、蒂腐病、青綠霉病、黑腐病等病害[9-10]。同時，咪鮮胺是柑橘采后保鮮的浸果藥劑[11-12]。咪鮮胺在水果中緩慢降解，最終代謝產物為2,4,6-三氯苯酚[13-15]。2,4,6-三氯苯酚在脂質組織中累積會影響人的神精系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的正常運轉，嚴重時會患白血病和淋巴瘤等疾病[16-17]。2,4,6-三氯苯酚易造成環(huán)境污染[18]，美國環(huán)保署已經把三氯苯酚列入環(huán)境污染物清單中[19]。

蘋果[20]、香蕉[21]、溫州蜜柑果實[22]、柑橘果實[23]、楊梅和楊梅酒[24]等水果及其加工產品在貯藏過程中的咪鮮胺殘留降解已有報道。金柑為可食皮類水果，與只可吃果肉的水果相比，金柑對人體的暴露風險更高，更應引起關注。然而，浸果保鮮處理后，咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚在金柑中的殘留隨貯藏時間消解變化及風險評估的研究鮮見報道。

本實驗中的金柑經3 種質量濃度咪鮮胺溶液、2 種浸泡時間進行保鮮處理。實驗建立氣相色譜-串聯(lián)質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）同時測定金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚含量的方法，并采用該方法分別測定室溫貯藏2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d金柑樣品中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的含量，分析不同浸泡質量濃度和浸泡時間的處理對金柑中咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留量的影響及其隨時間變化的動態(tài)特征，并評估浸果安全期后金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的慢性和急性膳食風險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金柑于2019年1月22—23日采摘自福建省尤溪縣管前鎮(zhèn)。

乙酸乙酯、丙酮、正己烷（均為色譜純），氯化鈉、硫酸鎂、PSA、碳黑（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑發(fā)展有限公司；咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚標準物質（純度均大于98%） 北京振翔有限公司；咪鮮胺水乳劑（質量濃度為450 g/L） 江蘇輝豐農化股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-TQ8050氣相色譜-三重四極桿質譜儀、Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 日本島津公司；MS3 basic高速渦旋振蕩儀 德國IKA公司；FW100粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；AL204天平瑞士梅特勒-托利多公司；Anke TDL-5A離心機 上海安亭科學儀器廠；turboVap LV全自動樣品濃縮儀 瑞典Biotage有限公司；PD500-TP均質機 英國PRIMA公司。

1.3 方法

1.3.1 浸果保鮮處理

挑選完整無缺陷、無蟲咬、無破損的金柑42.0 kg（約1 680 枚）作為備用樣品，每次浸果用樣品3.5 kg（約140 枚）。咪鮮胺浸泡液配制方法：將質量濃度450 g/L的咪鮮胺水乳劑用自來水分別稀釋至1 000、500、167 倍，其質量濃度為450、900、2 700 mg/L。將金柑樣品完全浸入咪鮮胺浸泡液中，每個質量濃度分別取浸泡2、5 min的樣品；對照樣品直接用自來水浸泡。每處理3 次重復（每種質量濃度浸泡液平均分成3 份，每份浸泡液單獨浸泡金柑，即獲得3 份重復實驗樣品），樣品撈起自然晾干后，置于室內20～25 ℃貯藏。

1.3.2 樣品制備

保鮮取樣方法按實驗設計要求，分別取浸泡后室溫貯藏2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的樣品。金柑樣品去除柄，取全果，用粉碎機磨碎，樣品－20 ℃冷凍貯存。

1.3.3 樣品提取與凈化

稱取樣品10 g，精確至0.01 g于50 mL離心管中。加入20 mL乙酸乙酯-正己烷（1∶1，V/V），加1 g NaCl均質處理0.5 min，加4 g MgSO4，再均質處理0.5 min，于室溫、4 000 r/min離心3 min。移取上清液8 mL于10 mL離心管，氮氣吹至約1 mL。加入150 mg PSA、100 mg碳黑，旋渦振蕩1 min至溶液無色，用乙酸乙酯正己烷溶液定容至2 mL。取上清液1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，進行GC-MS/MS上機測試。

1.3.4 儀器條件

氣相色譜條件：程序升溫，于50 ℃保持1 min，以40 ℃/min的速率升至200 ℃，再以15 ℃/min的速率升至250 ℃并保持3 min；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，恒壓流量控制120 kPa。

質譜條件：電子電離源，電離能量：70 eV，離子源溫度：200 ℃，接口溫度：250 ℃。

表1 咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚質譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS/MS測定數(shù)據(jù)由GCMSsolution 4.3軟件處理。農藥慢性、急性膳食風險按式（1）、（2）計算。

式中：HQc為慢性攝入風險；STMR為農藥殘留值；F為產品消費量，柑橘類水果為0.025 8 kg/d[25]；m為人群平均體質量，成年人為60 kg；ADI為每日允許攝入量，咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚總和，以咪鮮胺計為0.01 mg/kg[26]。HQa為急性攝入風險；LP為食品的最大消費量，柑橘為1.8678 kg/d[25]；HR為最高殘留量；ARfD為急性參考劑量，0.1 mg/kg[27]。HQc小于等于100.0%或HQa小于等于100.0%表示可接受的風險，HQc大于100%或HQa大于100.0%表示風險不可接受。

2 結果與分析

2.1 方法的確認

通過樣品加標逐級稀釋的方法信噪比為3時，確定檢出限（limit of detection，LOD），信噪比為10時確定定量限（limit of quantitation，LOQ）。當本實驗中咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的LOD分別為1.70、0.68 μg/kg，LOQ分別為5.0、2.0 μg/kg。水果蔬菜中咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的測定方法已有報道，其中采用氣相色譜儀測定咪鮮胺衍生物的LOD為5 μg/kg[28]，GC-MS/MS法直接測定咪鮮胺的LOD為辣椒3.3 μg/kg、水果4 μg/kg，2,4,6-三氯苯酚的LOD為辣椒3.3 μg/kg、水果5 μg/kg[29-30]。本實驗的LOD能滿足金柑中咪鮮胺及低含量2,4,6-三氯苯酚的測定。

以標準溶液的質量濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。咪鮮胺Y=3 763.645X－69 594.76，R2=0.996 7；2,4,6-三氯苯酚Y=13 535.01X－12 515.16，R2=0.999 2。方法線性相關系數(shù)R2大于0.996 7。

準確度和精密度通過向未檢出咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的金柑樣品中添加標準溶液評估。咪鮮胺添加50、100、500 μg/kg共3 個水平，2,4,6-三氯苯酚添加20、50、150 μg/kg共3 個水平，每個濃度水平測定7 次，測定回收率。

咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的平均加標回收率分別為95.7%、98.1%，平均相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為5.14%、3.89%。加標量的回收率和精密度能滿足本研究要求。

表2 金柑中咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的加標回收率及精密度Table 2 Recoveries and precision for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol in spiked kumquats

2.2 金柑中咪鮮胺的殘留動態(tài)

實驗分別比較450、900、2 700 mg/L共3 種浸泡質量濃度，于2、5 min浸泡時間的金柑中測定咪鮮胺的殘留消解動態(tài)，結果如圖1所示，3 種質量濃度浸果處理金柑中咪鮮胺的殘留量較高。在貯藏21 d內，咪鮮胺的殘留量均大于等于7.44 mg/kg，2 700 mg/L的高質量濃度浸果處理的殘留量更高，均大于10 mg/kg，其超出GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》對柑橘類水果的最大殘留限量值[26]。浸泡濃度越高、浸泡時間越長，金柑中的咪鮮胺殘留量也越高。所以，在保證保鮮效果的前提下，應降低浸泡濃度和減少浸泡時間。

圖1 咪鮮胺浸泡質量濃度和時間對金柑中咪鮮胺殘留的動態(tài)影響（n=3）Fig.1 Residual dynamics of prochloraz in kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time (n = 3)

在20～25 ℃室溫貯藏，金柑中的咪鮮胺含量先升高后降低，第3天達到峰值，450、900、2 700 mg/L咪鮮胺浸泡2 min的金柑中咪鮮胺含量分別達到9.66、12.22、15.43 mg/kg。第3天后，咪鮮胺殘留量降低緩慢。按照農藥登記推薦使用方法（450 mg/L浸果2 min）處理金柑，在農藥登記第14天的安全間隔期時，金柑中咪鮮胺的殘留量為8.18 mg/kg，小于最大殘留限量值10 mg/kg。若高于推薦質量濃度的900、2 700 mg/L分別浸果2 min處理，第14天金柑中咪鮮胺殘留量均高于最大殘留限量值。說明金柑咪鮮胺浸果處理應嚴格控制浸泡液濃度，按照推薦濃度或低于推薦濃度浸果處理，金柑的生產質量安全才能符合標準。

2.3 金柑中2,4,6-三氯苯酚含量的動態(tài)變化

如圖2所示，咪鮮胺浸泡的質量濃度和時間均是影響金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留的因素。按照咪鮮胺農藥登記使用說明方法（450 mg/L浸泡2 min）處理，浸泡后2 h，金柑中2,4,6-三氯苯酚的殘留量為0.028 mg/kg，結果與Fang Qingkui等[20]以相同濃度處理的蘋果中2,4,6-三氯苯酚殘留水平相當。浸泡質量濃度越高、時間越長，金柑中的2,4,6-三氯苯酚殘留量越大，當用質量濃度為2 700 mg/L的咪鮮胺浸泡5 min時，金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留量達到0.093 mg/kg。此外，2,4,6-三氯苯酚含量與咪鮮胺含量呈正相關，金柑中咪鮮胺含量高，其2,4,6-三氯苯酚的含量也高，因此2,4,6-三氯苯酚是咪鮮胺的分解產物。

圖2 咪鮮胺浸泡質量濃度和時間對金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留的動態(tài)影響（n=3）Fig.2 Residual dynamics of 2,4,6-trichlorophenol in kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time (n = 3)

隨著貯藏時間的延長，金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留量逐漸增加，直至21 d，2,4,6-三氯苯酚殘留量仍在增加，2 700 mg/L咪鮮胺浸泡5 min的2,4,6-三氯苯酚殘留量達0.152 mg/kg，此結果與Fang Qingkui等[20]得出蘋果中2,4,6-三氯苯酚濃度隨時間延長而增加的結果類似。因為2,4,6-三氯苯酚具有致癌性、結構穩(wěn)定，在環(huán)境中不易降解，其被美國國家環(huán)境保護局（United States Environmental Protection Agency，USEPA）列入環(huán)境污染物清單中，USEPA在飲用水中標識其風險質量濃度為3.1×10－7μg/L[19]。然而，目前為止，我國尚未對食品中2,4,6-三氯苯酚的最大殘留量進行限定。所以，從金柑以及其他水果中2,4,6-三氯苯酚的殘留累積效應及其對人體造成的危害方面考慮，應制定水果中2,4,6-三氯苯酚最高限量標準，并高度關注其攝入風險。

2.4 金柑咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚風險評估

咪鮮胺作為采后防腐保鮮劑使用，其在柑橘中的農藥登記使用安全間隔期為14 d。本實驗對浸泡后貯藏14 d的金柑中咪鮮胺攝入風險進行了評估，結果如表3所示，監(jiān)管殘留試驗殘留中值（supervised trials median residues，STMR）和最大殘留量（highest residue，HR）為咪鮮胺殘留量與以咪鮮胺計的2,4,6-三氯苯酚殘留量之和，其中2,4,6-三氯苯酚殘留量按2,4,6-三氯苯酚與咪鮮胺的分子質量比197.5∶376.8換算成咪鮮胺。表3中，HQc變化范圍為35.6%～70.3%，小于100 %；HQa變化范圍為296.4%～583.4%，均大于100%；風險評估結果說明用450、900、2 700 mg/L共3 種質量濃度浸泡處理金柑，14 d后咪鮮胺的慢性攝入風險在可接受的范圍內，但按每人每日最高攝入金柑1.867 8 kg計算咪鮮胺的急性攝入風險已超出了臨界值，風險不可接受。金柑是皮可生食的少數(shù)柑橘品種，相對而言，金柑比其他不可食皮的柑橘咪鮮胺急性攝入風險更高。所以，從風險評估結果分析，450 mg/L的咪鮮胺浸果2 min的使用方法不適用于金柑，建議修改其浸果使用方法，如：1）降低浸果濃度；2）減少浸果時間；3）單獨針對金柑類柑橘水果，登記咪鮮胺浸果的使用方法。

表3 浸泡不同咪鮮胺質量濃度和時間的金柑與其貯存過程中咪鮮胺的攝入風險Table 3 Risk of dietary exposure to prochloraz from kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time and its’ storage

3 結 論

本實驗建立GC-MS/MS法同時測定金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的方法，該方法有較低的檢出限、較寬的線性范圍、準確度和精密度，能滿足金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的準確定性和定量分析。咪鮮胺浸果處理，金柑中咪鮮胺殘留量先升高后緩慢降低，浸泡質量濃度越高、浸泡時間越長，咪鮮胺殘留量越大；450 mg/L浸泡2 min，金柑中咪鮮胺殘留量在咪鮮胺安全間隔期14 d為8.18 mg/kg，小于柑橘最大殘留限量值；更高浸泡質量濃度900、2 700 mg/L，貯藏14 d咪鮮胺殘留量均高于最大殘留限量值。直到21 d，2,4,6-三氯苯酚含量隨貯藏期的延長而不斷升高，450 mg/L浸泡2 min貯藏至第21天時，金柑中檢出值為0.072 mg/kg。對浸泡后貯藏14 d的金柑中咪鮮胺攝入風險進行評估發(fā)現(xiàn)，450、900、2 700 mg/L共3 種質量濃度浸泡處理金柑，14 d后咪鮮胺的慢性攝入風險在可接受范圍內，其急性風險不可接受。為降低咪鮮胺的攝入風險，應進一步研究咪鮮胺保鮮金柑的浸果濃度或時間對急性、慢性攝入風險的影響及其規(guī)律，以期為保障咪鮮胺貯存、保鮮金柑的安全性研究提供參考。